[发明专利]一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用

权利要求书

1.一种植物原位再生的方法，其特征是：

A、接穗的获得

选取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，作消毒无菌处理；接种于MS培养基中，于25℃光照培养箱中日光照16h，培养获得无菌苗；

取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切小段作为外植体，置于含有1mg/L 玉米素的MS培养基上，于25℃光照培养箱中诱导愈伤组织；获得新鲜愈伤组织作为接穗；

B、嫁接

取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口,将用作接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入砧木切口中嫁接；

C、砧木原位再生

嫁接后，愈伤组织接穗诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。

2.一种如权利要求1所述的植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，特征是：

A、接穗的获得

选取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，作消毒无菌处理；接种于MS培养基中，于25℃光照培养箱中日光照16h，培养获得无菌苗；

取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切小段作为外植体，置于含有1mg/L 玉米素的MS培养基上，于25℃光照培养箱中诱导愈伤组织；获得新鲜愈伤组织作为接穗；

B、农杆菌的准备

将农杆菌在含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB固体培养基上划线培养，28℃培养72小时；在平板上挑取单克隆，接种到含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素2ml液体YEB培养基，28℃，250rpm培养1-2d直至OD600为0.6；按照1:100的稀释比例将上述少量培养液继续扩繁培养到OD600为0.5；

C、农杆菌侵染

取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口，在伤口上涂抹农杆菌菌液，进行植物侵染；

D、嫁接

将接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入侵染过的砧木中嫁接，诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽；

E、转化的砧木原位再生

嫁接后，愈伤组织接穗诱导侵染过的砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。

3.根据权利要求2所述的植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，其特征是：农杆菌为EHA105、LBA4404、EHA101、KYRT1、GV3101或G58，优选EHA105；包含的质粒为PBI121，PBI121的左右边界内含有卡那霉素抗性基因NPTⅡ。

4.一种如权利要求2所述的一种植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，其特征是：用于原位再生植物包括番茄、大豆、棉花、桑树、花生、向日葵、番薯、马铃薯、苹果、烟草、薄荷、油菜、黄瓜和拟南芥。