[发明专利]一种测定痕量曲普瑞林的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用液相色谱与质谱联用技术测定痕量曲普瑞林的方法。

背景技术

曲普瑞林是人工合成的十肽，为促性腺激素释放激素(GnRH)的类似物。其结构的改良是将天然分子结构中的第六个左旋氨基酸(甘氨酸)，以右旋色氨酸取代。曲普瑞林作用与GnRH相同，但其血浆半衰期延长且对GnRH受体的亲和力更强，因此曲普瑞林成为GnRH受体的强力激动剂。曲普瑞林注射后，最初会刺激垂体分泌促性腺激素(Gn)，即黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。当垂体经过长期的刺激后会进入不应期，促性腺激素的释放会减少，因而使性类固醇(睾丸酮或雌激素)降低至去势水平。上述作用是可逆转的。临床上曲普瑞林被用于治疗各种激素依赖性疾病如前列腺癌、子宫内膜异位、子宫肌瘤和性早熟。

曲普瑞林已上市的产品主要有注射剂和长效缓释微球制剂，曲普瑞林临床常用剂量：每天一次皮下注射0.5毫克，连续七天，然后每天一次皮下注射0.1毫克，作为维持剂量；体外授精术(IVF)每天一次皮下注射0.5毫克，七至十天，然后每天一次皮下注射0.1毫克。曲普瑞林临床应用的不良反应是由于激素的产生被抑制而可能引起的药理副作用，因此临床治疗时应密切监测性类固醇血浆水平。曲普瑞林临床极低的用量，就可能引起极强的临床不良反应，这些情况都迫切需要建立一种操作简单，特异性好及高灵敏的痕量曲普瑞林检测技术，目前血浆及排泄物等生物样品中痕量曲普瑞林的检测是利用放射免疫法进行测定，由于它测定的是蛋白多肽的特异性片段，样品中其他有抗原决定簇的代谢片段或者曲普瑞林的自身降解产物也能和免疫试剂反应，增加结果误差，并且其具有放射性，对检测人员有潜在的伤害可能；且其试剂盒非常昂贵，必须配备高级仪器设备，不适合临床及科研使用。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺陷，本发明人进行深入研究，提供一种操作简单、结果准确、特异性好、灵敏度高的痕量曲普瑞林的测定方法。所述方法采用液相色谱与质谱联用技术，其高效液相的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为乙酸或丙酸，优选为乙酸；酸的体积百分浓度0.01-0.1％，优选为0.01-0.05％，更优选为0.02％。所述体积百分浓度为100ml水中所含酸的体积(ml)数。

在液质联用方法中，液相色谱流动相的选择具有非常重要的作用。本发明所述流动相的有机相选择甲醇，相比乙腈等其他有机溶剂，甲醇在测定痕量曲普瑞林时有更高的响应值和较好的色谱行为；流动相的水相中添加酸可明显提高方法的灵敏度，其中添加乙酸或丙酸比甲酸等其他酸，可以显著提高检测限近十倍。所述检测限是指在样品中能检出的被测组分的最低浓度(量)，即产生信号(峰高)为基线噪音标准差k倍时的样品浓度，一般将检测限定义为信噪比(S/N)3∶1时的浓度。

所述梯度洗脱含酸水溶液和甲醇的体积比具体如下表，其中第三时间段可省略，但优选含有第三时间段，可减少连续进样后柱压升高和噪音。

本发明另一方面还涉及所述测定痕量曲普瑞林的方法用于检测哺乳动物在使用曲普瑞林制剂后体内曲普瑞林的含量及其变化过程的用途。通过本发明所述的方法能够成功检测样品中的痕量曲普瑞林，实现在使用曲普瑞林制剂后，检测其体内曲普瑞林的含量及其变化过程。

本发明所述方法作为一种痕量曲普瑞林液质联用测定法，具有优于现有检测技术的灵敏度和特异性，可用于样品中痕量曲普瑞林的检测，为痕量曲普瑞林样品的检测，确定曲普瑞林制剂在体内的药物代谢研究提供了有效的检测手段。本发明所述方法可用于曲普瑞林制剂的开发，在临床上测定使用曲普瑞林患者体内药物浓度的变化，通过连续观察其动态变化能够为指导临床曲普瑞林的合理使用提供实验依据。

附图说明

图1 0.005ng/mL曲普瑞林标准溶液在流动相为0.02％乙酸水溶液-甲醇的液质检测图谱

图2 曲普瑞林微球在比格犬血浆中的平均药时曲线图谱

具体实施方式

下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1 流动相为0.02％乙酸水溶液-甲醇检测曲普瑞林

标准系列溶液样品的配制精密称取25mg曲普瑞林标准品，置25ml容量瓶中，加甲醇∶水∶甲酸(80∶20∶0.04)溶液溶解，并稀释至刻度，配制成1mg/ml的储备液。取曲普瑞林储备液适量，分别用甲醇∶水∶甲酸(60∶40∶0.08)稀释至0.005，0.01，0.03，0.1，0.3，1.0，3.0，10.0ng/ml。