[发明专利]β-1,4-内切木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)基因的克隆及表达

权利要求书

1.一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、归属于糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶催化域基因，其cDNA的核苷酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的新型木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.A.oryzae CICC 40186 Aor xyn10BC cDNA序列的获取方法：

基于我们申请的《β-1，4-内切木聚糖酶(Aor Xyn10B)基因的克隆及序列分析》及预测的催化域，设计两条引物Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1：

Xyn10BC-F1：5′-GAGCTGGTCTGCATGACGC-3′

Xyn10BC-R1：5′-CAAAACCTCCAAAATGCC-3′

以A.orvzae CICC 40186总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10BC-F1为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1为引物进行第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的条带经克隆、测序得到Aor xyn10BC cDNA序列。

4.A.oryzae CICC 40186木聚糖酶催化域基因工程菌的构建和表达方法：

(1)构建含编码Aor Xyn10BC成熟肽基因的表达质粒：基于上述得到的木聚糖酶催化域基因cDNA序列，设计一对引物Xyn10BC-F_o和Xyn10BC-R_o，获得已去除信号肽基因序列的催化域成熟肽基因：

Xyn10BC-F_o：5′-CTCGAGAAAAGAGCTGGTCTGCATGACGC-3′，含Xho I酶切位点

Xyn10BC-R_o：5′-GCGGCCGCTTACAAAACCTCCAAAATGCC-3′，含Not I酶切位点

以合成的cDNA第一条链为模板，M13 Primer M4和Xyn10BC-F_o为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10BC-F_o和Xyn10BC-R_o为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-xyn10BC与一种改造后的pPIC9K^M质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K^M-xyn10BC，并对重组质粒进行测序鉴定；

(2)GS115/xyn10BC的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K^M-xyn10BC进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn10BC；该工程菌用0.5％甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达20IU/mL；离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组木聚糖酶分子量为50kDa。