[发明专利]β-1,4-内切壳聚糖酶(Aus CsnA)基因的克隆及重组酶的制备

权利要求书

1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株糖苷水解酶第75家族(GH75)的新型壳聚糖酶基因(Aus csnA)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.由权利要求1所述的壳聚糖酶基因(Aus csnA)编码的新型壳聚糖酶(Aus CsnA)，其完整的氨基酸序列对应于序列表中的为SEQ ID NO：3。

3.Aus csnA完整mRNA和DNA序列的获取方法：

(1)Aus csnA 3′端mRNA序列的克隆：首先对Aspergillus fumigatus、Aspergillus oryzae和Aspergillus terreus GH75的壳聚糖酶序列进行同源比对，找出两段约8个氨基酸的保守序列，再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物Csn-F1和Csn-F2；

Csn-F1：5’-ATGGACAT(A/T)GACTGCGA(C/T)GG-3’

Csn-F2：5’-GCCAATAT(A/C)CA(T/C)CC(G/C)TATGTGGT-3’

以A.usamii E001总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Csn-F1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min；以M13Primer M4和Csn-F2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus csn 3′端mRNA序列；

(2)Aus csnA 5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aus csnA 3′端mRNA序列，设计两条反向引物Csn-RE1和Csn-RE2；

Csn-RE1：TTTGGTCTTGGATGGACTCG

Csn-RE2：CCCGTCGCAGTCTATGTCCA

以反转录合成的cDNA第一条链为模板、Outer Primer和Csn-RE1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以Inner Primer和Csn-RE2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus csnA 5′端mRNA序列；

(3)Aus csnA 5′端启动子序列的克隆：以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和Csn-RE1为引物，反应条件为：94℃4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；第二轮PCR以T-PrimerF和Csn-RE2为引物，反应条件为：94℃，4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus csnA 5′端启动子序列；

(4)Aus csnA 3′端转录终止区序列的克隆：以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以Csn-F1和T-PrimerR为引物，反应条件为：94℃4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；第二轮PCR以Csn-F2和T-PrimerR为引物，反应条件为：94℃4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-csnA3T)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序得到Aus csnA 3′端转录终止区序列；

4.Aus CsnA工程菌的构建和表达方法：

(1)含编码Aus CsnA成熟肽基因的表达质粒的构建：以M13 Primer M4和mCsn-F为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃60s；72℃10min)；以mCsn-F和Csn-R为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃45s；72℃10min)；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-csnA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Avr II进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-csnA，并对重组质粒进行测序鉴定；

(2)GS115/csnA的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-csnA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/csnA；该工程菌用1.0％甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组壳聚糖酶活性达80U/mL；发酵液经离心后的上清液为重组Aus CsnA粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组壳聚糖酶分子量为24kDa；该重组壳聚糖酶最适作用温度50℃，最适作用pH 5.0，该酶在pH 4.0～7.0、50℃以下稳定。