[发明专利]β-1,4-内切木聚糖酶(Aor Xyn10B)基因的克隆及序列分析

权利要求书

1.一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、归属于糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶基因，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别对应于序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述的新型木聚糖酶(Aor Xyn10B)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

3.A.oryzae CICC 40186 Aor xyn10B完整mRNA和DNA序列的获取方法：

(1)A.oryzae CICC 40186 Aor xyn10B 3′端mRNA序列的克隆：对10家族的Aspergillus fumigatus Af239、Aspergillus terreus NIH2624、Neosartorya fischeri NRRL 181、Aspergillus clavatus NRRL1和Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255木聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，设计两条简并引物Xyn10B-F1和Xyn10B-R1；

Xyn10B-F1：5′-A(A/G)CT(G/A/C)TACTACAACGACTAC-3′

Xyn10B-R1：5′-TACTT(A/G)TC(A/G)GTCCAGTCCC-3′

以A.oryzae CICC 40186总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和Xyn10B-F1为引物进行PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，52℃30s，72℃70s；72℃10min)；目的条带经克隆、测序得到Aor xyn10B 3′端mRNA序列；

(2)A.oryzae CICC 40186 Aor xyn10B5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aor xyn10B3′端mRNA序列，设计一条反向引物Xyn10B-R2；

Xyn10B-R2：5′-GCCGTAGGACTGGATTAGC-3′

以反转录合成的cDNA第一条链为模板、5′RACE Outer Primer和权利要求3(1)所述的Xyn10B-R1为引物进行第一轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；以5′RACE Inner Primer和Xyn10B-R2为引物进行第二轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃50s；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aor xyn10B5′端mRNA序列；

(3)A.oryzae CICC 40186 Aor xyn10B 5′端DNA序列的克隆：运用一种T载体介导的扩增方法，以经处理的A.oryzae CICC 40186基因组DNA为模板，以T-PriF和Xyn10B-R1为引物进行第一轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，52℃30s，72℃90s；72℃10min)；以T-PriF和Xyn10B-R2为引物进行第二轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，52℃30s，72℃80s；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aor xyn10B 5′端DNA序列；

(4)A.oryzae CICC 40186 Aor xyn10B 3′端DNA序列的克隆：基于上述得到的Aor xyn10B3′端mRNA序列，设计两条正向引物Xyn10B-F2和Xyn10B-F3；

Xyn10B-F2：5′-GCTAATCCAGTCCTACGGC-3′

Xyn10B-F3：5′-TTCTTCCAGCTCTCCCAG-3′

以经处理的A.oryzae CICC 40186基因组DNA为模板，以Xyn10B-F2和T-PrimerR为引物进行第一轮PCR扩增(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10B-F3和T-PrimerR为引物进行第二轮PCR扩增(94℃3min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aor xyn10B 3′端DNA序列；

(5)Aor xyn10B基因的生物信息学分析：将Aor xyn10B的5′和3′端mRNA序列进行拼接，得到自转录起始位点至poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架(Open Reading Frame)进行分析，进而推导出Aor Xyn10B的氨基酸序列；进行信号肽预测；将Aor xyn10B的5′和3′端DNA序列进行拼接，获得完整DNA序列，并对其5′端启动子区域和3′端转录终止区的功能进行预测。