[发明专利]β-1,4-内切甘露聚糖酶(An Man5A)基因的克隆与表达

说明书

技术领域

本发明涉及源自黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1菌株的一种新型的酸性β-1，4-甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA的克隆与分析，β-1，4-甘露聚糖酶工程菌的构建以及重组β-1，4-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程技术领域。 

背景技术

甘露聚糖是由特定的单糖残基(主要是甘露糖、葡萄糖和半乳糖)以α-和/或β-糖苷键连接而成的一类多糖的总称。在自然界储量丰富，仅次于木聚糖是植物半纤维素的第二大组分。由于其结构的复杂性，甘露聚糖的完全降解需要β-1，4-甘露聚糖酶，β-甘露糖苷键，β-葡糖苷酶以及α-半乳糖苷酶等的共同作用。 

β-1，4-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannanase EC 3.2.1.78)是一类能够水解甘露聚糖中的β-1，4-D-甘露糖苷键的内切酶，属于半纤维素酶。能够产生甘露聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。过去20年中，有大量的甘露聚糖酶被分离纯化出来，它们的基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕氏酵母等表达系统中进行了表达。甘露聚糖酶已广泛应用于饲料、造纸、食品和石油开采等工业领域。近年来，随着对自然界中半纤维素资源的开发、饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露寡糖生理功能的发现，β-甘露聚糖酶的需求量越来越大，导致对β-甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。但就国内外相关文献或专利报道来看，微生物β-甘露聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在众多领域中的广泛应用。为了提高β-甘露聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入90年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关β-甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关来源于黑曲霉(Aspergillus niger)β-甘露聚糖酶基因的克隆和表达等的研究未见有报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的酸性β-1，4-甘露聚糖酶基因完整mRNA序列的克隆和分析，β-1，4-甘露聚糖酶工程菌的构建以及重组β-1，4-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法。根据Henrissat等人提出的糖苷水解酶分类法，大多甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第5和26家族。 生物信息学分析表明该基因所编码的β-1，4-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族，命名为An Man5A，其对应的基因命名为An man5A。AnMan5A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。 

本发明的技术方案：一种源自A.niger LW-1的β-1，4-甘露聚糖酶基因(An man5A)，其完整mRNA和DNA序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。获取完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。 

A.nigerLW-1菌株由江南大学筛选和保藏，已于2007年在《食品与生物技术》杂志Vol.26，No.4，Pg.89公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。 

所述的完整mRNA序列推导的An Man5A氨基酸序列为SEQ ID NO：3。 

所述的重组An Man5A的活性测定方法： 

于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 3.6柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液配制的质量浓度为5g/L的角豆胶(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热5-10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃反应10min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加入去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个甘露糖酶活性单位(IU)。 

所述的An Man5A完整mRNA和DNA序列的克隆和表达方法：