[发明专利]提高小麦耐盐性的方法

权利要求书

1.一种提高小麦耐盐性的方法，其特征在于以下步骤：

a)构建一个海蓬子的水通道蛋白基因SbPIP1的表达载体pAHC25-SbPIP1；

b)通过基因枪法将海蓬子的SbPIP1基因的表达载体pAHC25-SbPIP1导入受体小麦幼胚细胞；对所述的小麦幼胚细胞进行愈伤组织诱导、植株再生，获得转基因待选植株；

c)对转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株；

d)阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T₄代转基因纯合株系；

e)对T₄代转基因纯合株系后代进行耐盐性筛选，获得耐盐的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的提高小麦耐盐性的方法，其特征在于：所述的海蓬子水通道蛋白基因SbPIP1表达载体pAHC25-SbPIP1通过以下步骤获得：

A、制备质粒PUC18-PSN：

设计上游引物SEQ No.5和下游引物SEQ No.6，以含Nos3’序列的质粒pCAMBIA-2301序列SEQ No.4为模板，以引物SEQ No.5和SEQ No.6扩增所述的模板，1％的琼脂糖电泳，对PCR产物进行纯化回收，以PUC18为基础质粒，采用限制性内切酶HindIII和PstI对Nos3’片段和PUC18分别进行完全双酶切，1％的琼脂糖电泳，对酶切片段进行回收，用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，选取阳性克隆提取质粒并采取酶切和测序的方法验证连接的正确性，获得质粒命名为PUC18-N；

设计上游引物SEQ No.7和下游引物SEQ No.8，以含有SbPIP1基因编码序列的海蓬子叶片cDNA文库为模板，以引物SEQ No.7和SEQ No.8扩增所述cDNA文库模板，1％的琼脂糖电泳，对PCR产物进行纯化回收，以PUC18-N为载体，采用限制性内切酶BamHI和PstI对SbPIP1基因编码序列和PUC18-N载体分别进行完全双酶切，1％的琼脂糖电泳，对酶切片段进行回收，用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，选取阳性克隆提取质粒并采取酶切和测序的方法验证连接的正确性，获得质粒命名为PUC18-SN；

设计上游引物SEQ No.9和下游引物SEQ No.10，以含有Ubiquitin基因启动子的玉米基因组为模板，以引物SEQ No.9和SEQ No.10扩增所述玉米基因组模板，1％的琼脂糖电泳，对PCR产物进行纯化回收，以PUC18-SN为载体，采用限制性内切酶BamHI和EcoRI对Ubiquitin和PUC18-SN分别进行完全双酶切，1％的琼脂糖电泳，对酶切片段进行回收，用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，选取阳性克隆提取质粒并采取酶切和测序的方法验证连接的正确性，获得质粒命名为PUC18-PSN；

B、制备pAHC25-SbPIP1表达载体：

采用限制性内切酶HindIII对PUC18-PSN质粒DNA进行完全酶切，切下Ubiquitin+SbPIP1+Nos3’嵌合基因片段，采用0.8％的琼脂糖电泳，对3.0kb左右的酶切片段进行回收；采用限制性内切酶HindIII对pAHC25质粒DNA进行完全酶切，切除原有表达盒，采用0.8％的琼脂糖电泳，对5.5kb左右的酶切片段进行回收；用T4DNA连接酶对两个回收片段进行连接，转化大肠杆菌，选取阳性克隆提取质粒并采取酶切和测序的方法验证连接的正确性，获得海蓬子水通道蛋白基因SbPIP1的表达载体，该质粒命名为pAHC25-SbPIP1。

3.根据权利要求1或2所述的提高小麦耐盐性的方法，其特征在于：对转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株是指：设计上游引物SEQ No.11和下游引物SEQ No.12，通过SEQ No.11和SEQ No.12对待选植株进行PCR筛选，电泳检测，能扩增出大小为58lbp的扩增片段的植株确定为阳性转基因植株。

4.根据权利要求3所述的提高小麦耐盐性的方法，其特征在于：对T₄代转基因纯合株系后代进行耐盐性筛选是指：在小麦的发芽期对被测后代采用在盐胁迫的条件下进行发芽试验，计算相对盐害指数，根据盐害指数判断转基因植株的耐盐性；

盐害指数＝[(对照发芽率-处理发芽率)/对照发芽率]×100％；

其中，对照发芽率是未导入pAHC25-SbPIP1的亲本在清水下的发芽率；处理发芽率是指T₄代转基因纯合株系后代在含1.0％ NaCl溶液胁迫条件下的发芽率；

耐盐性的分级标准由强至弱依次为1、2、3、4、5级，1级的盐害指数为0-20.0％，2级的盐害指数为20.1％-40.0％，3级的盐害指数为40.1-60.0％，4级的盐害指数为60.1％-80.0％，5级的盐害指数为80.1％-100.0％，其中1级为耐盐的转基因植株。