[发明专利]一种腺病毒载体及其在制备HCV细胞和小鼠模型中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种腺病毒载体及其在制备HCV细胞和小鼠模型中的应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一，严重威胁人类健康。目前尚没有有效的HCV预防性疫苗，而HCV模型，尤其是感染性模型的缺乏，也阻碍了HCV疫苗研发及致病机制研究，从而增加了其防控难度。现有的HCV感染性小鼠模型主要是免疫缺陷型人肝嵌合小鼠，不能用于HCV疫苗评价及致病机制研究。(Mercer DF，Schiller DE，Elliott JF，Douglas DN.，Hao C，RinfretA，Addison WR，Fischer KP，Churchill TA，Lakey JR，Tyrrell DL，Kneteman NM.Hepatitis Cvirus replication in mice with chimeric human livers.Nat Med 2001；7：27-933.)。

第三代腺病毒载体，又称空壳载体或辅助病毒依赖型腺病毒(HDAd，helper-dependent adenovirus)载体，它去除了腺病毒全部的编码反式作用蛋白的基因，仅保留了两端的反向末端重复序列以及包装信号，其去除的腺病毒蛋白编码序列的功能由辅助病毒提供。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组腺病毒载体。

本发明提供的重组腺病毒载体，为将序列表中序列1所示的核苷酸插入腺病毒载体HDAd中得到的载体。

上述重组腺病毒载体具体为将序列表中序列1所示的核苷酸插入腺病毒载体HDAd的I-Ceu I和I-Sce I位点间得到的载体。

由上述重组腺病毒载体包装得到的腺病毒。

上述腺病毒为将上述重组腺病毒载体转染表达Cre重组酶的293细胞，包装得到的腺病毒。

上述腺病毒具体按照如下方法制备：将上述重组腺病毒载体经Pme I线性化后与辅助病毒AdNG163共转染表达Cre重组酶的293细胞，包装得到腺病毒。

本发明的另一个目的是提供一种转基因细胞，为将上述腺病毒导入宿主细胞中得到的细胞。

上述转基因细胞中，所述宿主细胞为Huh7细胞。

上述的重组腺病毒载体或上述的腺病毒在制备筛选抗HCV药物的细胞模型中的应用。

上述的重组腺病毒载体或上述的腺病毒在制备用于筛选抗HCV药物小鼠模型中的应用。

上述的重组腺病毒载体或上述的腺病毒或上述的转基因细胞在筛选抗HCV药物中的应用。

本发明的实验证明，本发明提供了一种重组HCV 2a型JFH1全长基因组的第三代腺病毒载体，其制备得到的腺病毒可以用来制备HCV全基因组细胞模型或小鼠模型，得到的模型可以用来进行抗HCV药物筛选，从而用于HCV疫苗评价及致病机制研究。

附图说明

图1为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞GFP及HCV core和NS3免疫荧光检测结果。

图2为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞HCV core和NS3 Western blot检测结果。

图3为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞HCV RNA Northern blot检测结果。

图4为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞及上清中HCV RNA实时定量检测结果。

图5为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞培养上清再感染Huh7细胞HCV core和NS3免疫荧光检测结果。

图6为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞培养上清HCV感染性被人CD81单克隆抗体阻断实验。

图7为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞培养上清HCV感染性被HCV E2单克隆抗体阻断实验。

图8为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞透射电镜及上清针对HCV E2的免疫电镜结果。

图9为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞模型用于IFN-α抗HCV作用评价。

图10为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠肝组织HCV core和NS3Western blot检测结果。

图11为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠肝组织HCV RNA Northern blot检测结果。

图12为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠血清HCV RNA实时定量检测结果。