[发明专利]一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以芝麻下胚轴为外植体的农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，属于植物转基因技术领域。

背景技术

近年来转基因技术已成为植物分子生物学研究强有力的实验手段，更是基因功能和基因组研究必不可少的实验工具。由于芝麻属于植株再生较困难的作物，芝麻转基因技术进展缓慢。我国尚未有芝麻转基因获得成功的研究报道，国外公开报道的芝麻转基因技术多采用农杆菌侵染茎尖等外植体，通过诱导丛生芽获得转基因植株。但由于此方法不具有重复性，转化效率低，不能很好地用于芝麻分子生物学研究。因此，当前急需探讨一种稳定高效的芝麻遗传转化技术方法，为芝麻重要基因的功能验证及芝麻T-DNA插入突变体库构建等提供技术支撑。

发明内容

本发明目的在于提供一种以芝麻下胚轴为外植体，采用农杆菌介导进行外源基因转化成功获得抗性芝麻愈伤组织及植株农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法，由以下方法获得：

(1)以萌发芝麻种子的下胚轴为外植体，进行农杆菌侵染和共培养；

(2)对外植体进行抗性愈伤组织的诱导及再生；

(3)通过获得抗性愈伤组织进而获得抗性再生植株；

(4)通常PCR和GUS染色方法检测植株。

步骤(1)中外植体的获得方法如下：首先挑选饱满健康的芝麻种子，在超净工作台内表面消毒后，加入无菌水培养到种子露白；然后在无菌条件下接种于培养基上，在25℃～28℃的温度下培养，下胚轴长约4-5cm时，将下胚轴切成0.2-0.8cm时小段待用。

所述的培养基的组成为MS培养基+30g·L^-1蔗糖+8g·L^-1琼脂粉，pH为5.8。

步骤(1)的侵染和共培养为：在超净工作台上，用共培养液体培养基将带有表达载体质粒(如pBI121)的农杆菌4404菌株稀释至OD₆₀₀值为0.5；将切好的0.5cm芝麻下胚轴小段浸泡在农杆菌液体中，10min后，用灭菌滤纸吸干外植体周围多余的菌液；将外植体放在铺有一层灭菌滤纸的共培养固体培养基上，用封口膜封口，共培养2天。

所述的液体培养基组成为：MS+0.1mg·L^-1NAA+2mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖，pH为5.8。

所述的固体培养基组成为MS+0.1m g·L^-1NAA+2mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+8g·L^-1琼脂，pH为5.8。

步骤(3)的抗性愈伤组织诱导及再生具体为：先共培养2天后，将外植体放于抗性愈伤诱导培养基上；待愈伤上出现绿色的小芽时，将其剥离继代到抗性筛选培养基上，之后进行生根培养。

所述的抗性愈伤诱导培养基组成为：MS+0.1mg·L^-1NAA+2mg·L^-16-BA+8g·L^-1琼脂+30mg·L^-1卡那霉素+500mg g·L^-1头孢霉素+30g·L^-1蔗糖。

所述的继代到抗性筛选培养基组成为MS+8g·L^-1琼脂+20mg·L^-1卡那霉素+200mg·L^-1头孢霉素+30g·L^-1蔗糖，pH为5.8。