[发明专利]利用葡萄糖产丁二酸的基因工程菌株及其发酵产酸方法

权利要求书

1.一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 BA205（Escherichia coli BA205），其保藏登记号为CCTCC M 2011447。

2.权利要求1所述的大肠埃希氏菌 BA205的构建方法，其特征在于其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶后，得到能够高效利用葡萄糖生长并产丁二酸大肠埃希氏菌 BA205。

3.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌 BA205的构建方法，其特征在于具体构建步骤如下：

（1）以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；

（2）合成一对5’端带有酶切位点的引物，以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，纯化扩增出的pck基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pck； 

（3）合成一对5’端带有相同酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的pncB基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-pck用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pck-pncB； 

（4）将重组质粒pTrc99a-pck-pncB导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；

（5）利用步骤（4）的阳性转化子过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到高效利用葡萄糖代谢产丁二酸基因工程菌大肠埃希氏菌 BA205。

4.利用权利要求1所述的大肠埃希氏菌 BA205发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌 BA205按1%(v/v)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.4～0.6用0.3 mM的IPTG诱导至OD₆₀₀=3时，按接种量10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的厌氧阶段发酵培养基是以葡萄糖为碳源的产丁二酸大肠杆菌用发酵培养基。