[发明专利]一种采用定向交叉偶联技术制备的短肽抗体试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体检验试剂盒，特别涉及短肽抗体ELISA检验试剂盒。 

背景技术

研究表明，II型胶原(CII)是与RA发病相关的主要自身抗原之一。抗类风湿肽(NTAP)作为一种基于CII主要抗原结合位点(263-272序列)的变构肽，将原型肽中与TCR结合的氨基酸残基替换，保留与HLA-DRβ1结合的氨基酸，从而能够竞争性地抑制自身致病抗原与HLA-DRβ1分子的结合，却不被TCR识别，特异性地阻断抗原肽-HLA-TCR复合物的形成，从发病上游阻断RA病理免疫应答，达到治疗RA的目的。NTAP作为RA治疗的潜力药物，具有很高的开发和应用价值。 

作为一种多肽，NTAP在体内可能会产生相应的抗体。NTAP抗体的检验对于评价NTAP的安全性和药效均有很大的作用，是NTAP开发成药品的安全性检验的必检之项。作为创新药物，NTAP没有现成可用的抗体检测方法，因此开发一种灵敏、可信的NTAP抗体检验方法，势在必行。 

夹心法和直接法是制备ELISA检测试剂盒的常规方法，由于NTAP是仅由十个氨基酸组成的短肽，采用常规方法制备短肽抗体的ELISA检测试剂盒非常困难。 

夹心法：即双抗体夹心法，利用连接于固相载体上的抗体结合抗原，实现血清中抗原特异性抗体的检测，由于NTAP属于短肽，没有过多的抗原决定簇或可结合区域，因此该方法不易实现。 

直接法：即直接将抗原吸附在载体表面上的方法，而由于NTAP分子量太小，直接包被在固相载体上的效果不好，所得酶标板的检测效果均一性差，检测结果的重现性不佳。 

同时，由于短肽不具有或仅有较低免疫原性，短肽阳性对照抗体不易获得。现有技术通常使用偶联载体蛋白的方法制备短肽抗体，但是试验发现NTAP直接偶联载体蛋白无法获得满足检测的高效价的抗体。 

NTAP仅由10个氨基酸组成，在体内较难形成抗体，且由于其属于短肽，因此没有过多的抗原决定簇或可结合区域，因此用传统的阳性抗体制备的方法不能获得满足检测的高效价阳性对照抗体、亦无法用常规的夹心法或直接法制备包被板及得到检验试剂盒。 

发明内容

本发明旨在用酶联免疫的方法结合NTAP的特点，采用定向交叉的偶联方法，开发出一种能简单、准确的检验血清中NTAP抗体的检验方法，以求解决NTAP抗体检验的难题。 

本发明提供了一种用于NTAP抗体检测的酶标板，是包被有NTAP的酶标板。包被有NTAP的酶标板，NTAP的C端连接半胱氨酸(Cys)，再在半胱氨酸上连接载体蛋白。其载体蛋白选用牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)等大分子白蛋白，优选为牛血清蛋白(BSA)。所述偶联方法为常规方法，如DDC法(二环己基碳二亚胺法)，EDC法(对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺法)，戊二 醛法或N-琥珀酰亚胺法，其中优选EDC法。用于包被抗原的固相载体物质为常规物质，可以为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。载体的形式为常规形式，可以是试管、微量反应板凹孔、小珠或小圆片等。 

本发明还提供了一种NTAP抗体ELISA检验试剂盒。本发明的NTAP抗体检验试剂盒包括包被有NTAP的酶标板，纯化抗体，酶和二抗。 

所述包被有多肽药物NTAP的酶标板，是包被有抗原的固相载体，根据抗原抗体特异性结合原理检测受试者体内是否有抗体产生。所述包被有NTAP的酶标板，NTAP的C端连接半胱氨酸(Cys)，定向偶联于载体蛋白，其载体蛋白选用牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)等大分子白蛋白，优选为牛血清蛋白(BSA)；所述偶联方法为常规方法，如DDC法(二环己基碳二亚胺法)，EDC法(对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺法)，戊二醛法或N-琥珀酰亚胺法，其中优选EDC法；用于包被抗原的固相载体物质为常规物质，可以为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式为常规形式，可以是试管、微量反应板凹孔、小珠或小圆片等。