[发明专利]一种重组中华田园犬α干扰素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组犬α干扰素的制备方法。

背景技术

随着经济发展和人民生活水平的提高，犬作为伴侣动物已成为人们生活中不可缺少的一部分。犬瘟热、犬细小病毒病等犬类疾病严重危害犬的健康和养犬业的发展。α干扰素(Interferon-a，IFN-a)是由动物白细胞或成纤维细胞产生的一类分蛋白，具有广谱抗病毒和增强免疫作用，可用于犬病毒病的治疗。

利用原核表达系统体外表达某些特定的蛋白是常用的蛋白生产手段之一，其最大的优点为蛋白产量高、操作相对简便，目前已有不少成熟的原核表达系统。传统的重组蛋白表达与纯化通常是在目的蛋白前或后加上特定的标签（如GST tag、His tag等），形成的融合蛋白可借助蛋白标签进行亲和层析，层析柱价格昂贵，使得蛋白纯化成本较高，且纯化的融合蛋白往往需进行体外裂解去除蛋白标签后才能获得很好生物学活性的目的蛋白，常用的裂解方法主要有化学裂解法（如溴化氰、羟胺、BNPS-3-甲基吲哚等）和酶解法（如Xa因子、凝血酶、肠激酶、胶原酶、凝乳酶等）。化学裂解虽价廉、有效，但由于裂解位点特异性低，还可能对目的蛋白产生不必要的修饰，该方法逐渐被酶解法代替，而酶解去除标签，所用的裂解酶价格不但高，还不可避免地混入目的蛋白中，造成新的污染，使得蛋白纯化更加复杂。有些原核表达系统在表达外源蛋白时，虽然不需要借助蛋白标签来进行纯化，但要想分离出表达的蛋白，往往还是离不开价格昂贵的层析柱（王艳，任启生等人在制备重组犬干扰素时就碰到相关问题），由于上述原因，最终获得均一的目的蛋白成本高、周期长，成为制约体外规模化生产目的蛋白的瓶颈性问题。

弹性蛋白样多肽（Elastin-like polypeptide, ELP）是一VPGXG（X可为任何氨基酸）五肽组成重复序列，当孵育温度高于相变温度（Phase transition temperature, Tt）时，可自发地从溶液中沉淀析出，而低于Tt时则呈现可溶状态，当与其他蛋白融合在一起时，仍具有该特性。弹力样多肽（Elastin-like polypeptide，ELP）-蛋白内含肽（intein）介导的新型大肠杆菌表达系统pELP-I相对其他原核表达系统在制备重组蛋白时，能有效避免昂贵的层析技术。具体方法是将外源基因插入载体pELP-I ELP-intein基因的下游，在大肠杆菌工程菌中低温诱导融合蛋白ELP-Intein-重组蛋白融合体的表达。根据ELP在1.5mol/L NaCl溶液中和高于Tt温度析出的特性，常规的离心法获得了较纯的融合蛋白ELP-Intein重组蛋白；再利用Intein自身切割作用释放出不含融合标签的重组蛋白，经再次离心去除ELP-Intein，获得了纯化的重组蛋白。此重组蛋白的分离纯化过程简单，不需专门设备，获得的重组蛋白无需用蛋白酶裂解去除融合标签，且纯度高和成本低，特别适合规模化生产和兽医临床使用，目前Wu已用该方法纯化出绿色荧光蛋白，但在犬干扰素尤其是抗病性较强的中华田园犬重组CaIFNα的制备上未见应用。

发明内容

为了解决现有的重组CaIFNα制备成本高问题，本发明构建了一新的CaIFNα重组原核表达载体，该载体便于CaIFNα重组蛋白的表达、纯化，且操作简便、纯化成本低，表达的重组CaIFNα不带有其他任何外源蛋白，经Triton114处理，可去除其中的内毒素，这在重组犬α干扰素的规模化生产上有着很好的应用前景。

本发明所述的重组中华田园犬α干扰素的制备方法，是将PCR扩增出的无信号肽中华田园犬α干扰素基因插入载体pELP-I-GFP 限制性内切酶BsrG I、HindIII酶切位点之间，构建得到原核表达载体pELP-I-CaIFN-α；再用pELP-I-CaIFN-α转化感受态宿主细胞，经温度诱导表达、纯化后，用Triton114去除其中的内毒素得到重组中华田园犬α干扰素。

本发明方法包括如下步骤：

1）中华田园犬α干扰素无信号肽基因的扩增：

a. 以P1、P2为引物，以中华田园犬总RNA为模板RT-PCR扩增出无信号肽的犬α干扰素基因；

P1：5’gatgtacacaacatgtgccacctgcccgacac3’，P2：5’ggaagctttcatttcctcctcctg3’；