[发明专利]一种人气道上皮细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明是一种人气道上皮细胞的培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

气管或支气管是下呼吸道的重要组成部分，气道上皮细胞是呼吸道的重要防御屏障，已有研究发现，反复的呼吸道感染与粘膜上皮功能失调密切相关，因此，气道上皮细胞是探寻COPD、哮喘等呼吸系统常见疾病发病机制的重要研究材料。气道上皮细胞离体后，生物学特性尚未发生变化，能在一定程度上反映体内状态，并显示亲体组织的形态学特征和细胞生物学特性，因此体外气道上皮细胞的原代培养和细胞株的建立是研究亲体组织生物学特性的有效手段，同时也为研究呼吸道疾病发病机制及其防治措施提供研究工具。另外，我国的气管移植技术一直处于实验研究阶段，组织工程气管是气管移植的重要手段，而气道上皮细胞作为种子细胞是组织工程气管中不可缺少的部分，因此找到一种简便、高效的气道上皮培养方法对研究呼吸系统疾病发病机制以及开展气管移植都具有重要的意义。

目前，气道上皮细胞的培养方法主要有：胰酶和/或蛋白酶消化结合机械剥离粘膜法和/或机械刮刷法，这些方法都存在以下缺点：(1)机械剥离粘膜法/机械刮刷法是采用镊子等器械在气管或支气管上进行钝性分离，其操作难度大，且在剥离过程中容易损伤上皮细胞，获得的存活细胞少，且细胞活力差。(2)胰酶消化/蛋白酶消化法是采用胰酶/蛋白酶溶液对气管或支气管进行消化处理，以获得上皮细胞，但是胰酶/蛋白酶的消化力很强，且消化时间不易掌握，易对上皮细胞造成损失，细胞获得率少，细胞存活率低且活力差。另外，尚存在以下原因导致以人气道上皮细胞为来源的细胞培养受到限制：1.肺脏为一开放性脏器，因此获得的气道在进行细胞培养的过程中易发生污染，同时由于患者气道含有大量粘蛋白等渣滓而增加了细胞分离的难度；2.可用于分离气道上皮细胞的标本，都是从手术切除下来的具病灶的部位，标本数量有限，且标本中的正常的气管或支气管很少，如采用一般的气道上皮细胞培养方法，对细胞损伤大、获得率低再加上细胞贴附能力差，最后成活的细胞数量极少；3.气道上皮细胞原代培养中，最容易引进成纤维细胞污染，成纤维细胞生长快、活力好，具有生长优势，最终造成原代气道上皮细胞培养失败。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、简便、高纯度的人气道上皮细胞的培养方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种人气道上皮细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)获取原代培养的人气道上皮细胞：取离体人气管或支气管，用消化培养基在4℃消化24～48h后收集气道上皮细胞，然后接种至培养皿中，用完全培养基进行原代细胞培养，获得原代培养的人气道上皮细胞；

(2)获取传代培养的人气道上皮细胞：

当原代细胞达到70～90％融合密度后，用磷酸缓冲液(PBS)溶液清洗，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室温消化5～10分钟，当细胞出现回缩、悬浮时，收集细胞悬浮液，加入含有蛋白酶抑制剂的等量溶液，离心收集细胞，然后以1～6×10⁶细胞/ml的浓度接种于新的含完全培养基的培养皿中进行培养，3～5天细胞生长至对数生长期，获得传代培养的人气道上皮细胞。

所述步骤(2)中胰蛋白酶溶液中含0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)；在培养皿中，每100mm单孔板的胰蛋白酶溶液的用量为1ml。

所述步骤(2)中蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitor)，浓度为0.5～1mg/ml。

所述步骤(1)中获取原代培养人气道上皮细胞的具体步骤为：

1>在显微镜下分离弃除气管或支气管上所有额外的结缔组织，然后切成小段组织块，用预冷的生理盐水清洗，将分离干净的气管或支气管浸泡在浸泡培养基中，涡旋震荡30～60s后，浸泡5～10min，接着用洗涤培养基冲洗干净，把洗好的组织块置于离心管内，加入消化培养基，4℃，在摇床上以转速50～60r/min消化气管或支气管组织块24～48h；

2>取出经消化的气管或支气管组织块倒入培养皿中，加入胎牛血清至终体积浓度为10～20％，纵向剪开气管，用细胞刷轻刮内表面，然后用磷酸缓冲液冲洗内表面和细胞刷，收集含有脱落细胞的溶液，4℃离心5min后，用洗涤培养基清洗细胞，4℃离心5min后，用完全培养基重悬细胞；

3>用完全培养基调整细胞密度，以1～6×10⁵细胞/ml的密度接种于培养板中，于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养2～3天，得到原代培养的人气道上皮细胞。