[发明专利]高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵及其酶工程化应用领域，具体涉及一种高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌(Hypocrea sp.)W63及所产的β-葡萄糖苷酶，以及该β-葡萄糖苷酶在同步糖化发酵上的应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶，英文名称β-glucosidase，简称BG，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键，从而释放出葡萄糖的酶。β-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，几乎在所有生物体中都有，因其来源不同而性质各异，在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。

在纤维素酶水解纤维素的过程中，纤维素类物质经酶促作用成葡萄糖至少需要三种酶的协同作用，葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶把纤维素降解成纤维二糖，它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖释放葡萄糖是一个关键限速步骤。目前，市场上应用的β-葡萄糖苷酶在水解过程中，β-葡萄糖苷酶活性易受水解产物葡萄糖的抑制，而纤维二糖又是纤维素酶系中其他酶的抑制剂，从而会造成整个纤维素的水解过程受到抑制；其次，在产纤维素酶的菌株中，β-葡萄糖苷酶含量都很低(除黑曲霉外)，远达不到实际应用的水平；再次，在大量的反应过程中，热处理会使大部分的β-葡萄糖苷酶酶活性丧失。一般来说，来自植物的β-葡萄糖苷酶最适温度在40℃左右，大多数微生物来源的β-葡萄糖苷酶的最适作用温度在50℃左右。目前，制约纤维素乙醇产业化的一个关键瓶颈就是纤维素酶的使用成本较高。其中缺乏有效的商业化β-葡萄糖苷酶是一个关键因素。因此，开发寻找嗜温、耐醇、高活性的β-葡萄糖苷酶对于加快纤维素乙醇的产业化进程，预期将会有很大的促进作用。

除了在纤维素降解中的应用外，β-葡萄糖苷酶还有多种用途。在果汁行业中，人们利用β-葡萄糖苷酶对糖苷键的作用增加果汁的香气；在食品行业中，人们利用它对一些生氰物质降解以脱除食品加工原料的毒性。因此，通过高通量筛选技术筛选高效产酶菌株，对于探索β-葡萄糖苷酶的多样化应用具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌(Hypocrea sp.)W63，该菌于2011年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.5209。

本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63是从枯枝烂叶、土壤、真菌子实体等材料中筛选培养出来。其真菌分类学表明：该菌菌丝体呈白色，菌落小而致密，呈棉絮状，可产绿色孢子。PDA培养基培养1天开始长白色菌丝，培养3天以上开始长绿色孢子。该菌菌丝体及孢子如图1所示。

本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63的分类学地位根据下述方法确定：

常规方法提取该真菌的18s rDNA，其序列如SEQ ID NO.1所示，该序列已提交到GenBank，其序列登记号为JN935058，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的18S rDNA序列，构建系统发育树，如图2所示。经比较分析，本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63属于肉座菌属，将其命名为肉座菌(Hypocrea sp.)W63，该菌于2011年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.5209。

本发明的第二个目的是提供了一种以肉座菌(Hypocrea sp.)W63为发酵菌株，经液体发酵而制得的β-葡萄糖苷酶。