[发明专利]一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物及方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。猪瘟在世界上许多养猪国家都有不同程度的流行，OIE将其规定为必须申报的动物传染病之一。近年来，猪瘟成为影响我国养猪业健康发展的一大隐患。在猪瘟的防控方面，发达国家普遍采取扑杀患病猪和带毒猪从而达到对该病的净化，如欧盟从20世纪90年代开始采取对猪瘟患猪和猪瘟病毒感染猪进行宰杀的方式而达到对该病的净化；我国采取的是疫苗免疫接种为主的政策。我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗是国际公认的最安全有效的弱毒疫苗，在我国乃至全球得到广泛应用，为猪瘟的防控做出了巨大贡献。弱毒疫苗免疫猪后虽然可以产生完全的保护，但也存在无法从血清学上区分猪瘟病毒感染猪和疫苗免疫猪的问题，给猪瘟病毒感染猪和疫苗免疫猪的鉴别诊断带来了很大困难。因此亟待建立一种可以准确区分猪瘟病毒疫苗免疫猪与猪瘟病毒野毒感染猪的检测方法。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR反应类似于DNA的天然复制过程，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，即在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模版DNA链互补的半保留复制链。通过PCR，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，具有特异、敏感、产率高、快速简便、重复性好、易于自动化等突出优点，PCR已广泛应用于生物检测和疾病诊断等领域。由于猪瘟病毒基因组是单股正链RNA，因此需用RT-PCR的方法来扩增病毒目的片段。反转录酶链反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的基本原理是以所需检测的病毒RNA为模版，反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。典型的RT-PCR包括样品RNA的制备、引物的设计和合成、反转录合成cDNA、以cDNA为模板进行PCR扩增，、扩增产物的检测。合理的引物设计是成功应用RT-PCR技术的关键。引物的特异性对反应有很大影响，如果引物特异性不高，可能在扩增过程中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。对同种病毒的不同毒株进行检测，则应选择该株系的特异序列区进行引物设计。

对于猪瘟病毒疫苗株与野毒株的检测，更好的专用引物和检测条件是该领域研究的重要技术问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物。

本发明的另一目的在于提供所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的方法；该方法通过应用上述鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物实现。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物，其核苷酸序列如下所示：

CSFV-P1：5’-AGTAGGACCCTATTGTAGATAA-3’；

CSFV-P2：5’-AGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3’；

所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物在猪瘟病毒检测中的应用；

所述的猪瘟病毒为猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)或CSFV野毒株(GXW-07)。

一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的方法，通过使用上述引物实现；具体包含以下步骤：

(1)PCR反应：引物为CSFV-P1和CSFV-P2，模板为猪样本的cDNA；得到扩增产物；

(2)结果判断：通过电泳检测扩增产物，做出如下判断：

①没有扩增产物，证明所检测的猪样本没有猪瘟病毒感染；

②有扩增产物的，扩增产物长度为154bp，证明所检测的猪样本为猪瘟病毒疫苗免疫猪；

③有扩增产物的，扩增产物长度不是154bp，初步证明所检测的猪样本为猪瘟病毒野毒感染猪；通过对扩增产物进行测序，进行猪瘟病毒种类的确认；

步骤(1)中所述的猪样本的cDNA可通过使用随机引物、OligodT或者CSFV-P2对猪样本的总RNA逆转录得到；逆转录的条件根据所使用的逆转录酶的说明书推荐的反应体系和反应参数操作即可；