[发明专利]犬恶丝虫核酸疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种犬恶丝虫核酸疫苗，用于犬恶丝虫病的预防和治疗，同时还提供了该疫苗的制备方法，属于生物制品制备技术领域。

背景技术

犬恶丝虫病是由犬恶丝虫（Dirofilaria immitis）成虫寄生于犬的右心室、肺动脉内，使患犬形成机械性栓塞，影响心肺功能，导致呼吸衰竭、循环和泌尿系统遭受严重损伤的寄生线虫病。犬、猫科动物是本病的天然宿主，野生肉食动物、马属动物、海狸、猩猩、麝鼠、灵长类等偶见感染，还可以感染人类。该病虽经多年研究，迄今尚无理想的防治药物以及预防和治疗办法。因此，利用获得的免疫相关基因制备核酸疫苗以刺激机体产生的免疫应答的免疫干预可能是控制犬恶丝虫病更合适的途径。

发明内容

本发明目的是提供一种犬恶丝虫核酸疫苗，是抗犬恶丝虫的新型疫苗，对于犬恶丝虫病的预防有明显效果。

本发明还提供了该疫苗的制备方法，适用于工业化生产。

本发明公开的犬恶丝虫的保护性抗原基因基因（命名为GSP1），如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述保护性抗原基因的扩增引物，其特征在于：

F1：5’ –GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3’，

S1：5’-CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3’。

本发明提供的犬恶丝虫核酸疫苗，其特征在于：将犬恶丝虫保护性抗原基因插入到真核载体pVAX1，获得了核酸疫苗pVAX1-GSP1。

本发明公开的犬恶丝虫核酸疫苗的制备工艺，包括以下步骤：

根据犬恶丝虫保护性抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行PCR，与克隆载体PMD18-T连接；

将克隆所得的两个保护性抗原基因分别插入到真核表达载体pVAX1，构建犬恶丝虫核酸疫苗；

将构建的核酸疫苗分别转染Hela细胞，经转染细胞的间接免疫荧光、SDS-PAGE电泳、以及 Western blot进行表达产物分析，并对免疫小鼠进行特异性抗体效价以及CD4⁺ 和CD8⁺ T淋巴细胞数量的检测以验证其免疫效果。

本发明积极效果在于：选用了保护性抗原基因进行了核酸疫苗的研制，以获得免疫保护。犬恶丝虫核酸疫苗能引起机体较强的细胞免疫和体液免疫反应，从而可以达到预防犬恶丝虫病的目的。

附图说明：

图1：重组质粒pVAX1-GSP1的酶切鉴定图；

图2：转染细胞的间接免疫荧光 ；

图3：pVAX1- GSP1转染Hela细胞表达产物Western Blot 分析；

图4：重组蛋白疫苗免疫小鼠血清特异性抗体IgG抗体效价测定。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例1：

犬恶丝虫核酸的制备

本发明以犬恶丝虫免疫相关基因GSP1为例，进行真核表达载体的构建。犬恶丝虫核酸疫苗的制备步骤如下：

1、参照GSP1基因序列开放性阅读框及真核表达载体pVAX1图谱设计引物并引入酶切位点。根据目的基因序列，设计两对引物用来扩增GPS1片段：

F1：5’ –GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3’，下划线为BamH I酶切位点。S1：5’-CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3’，下划线为Xho I酶切位点。

2、以制备的含有GPS1插入片段的噬菌体基因组为模板扩增。PCR反应条件：（95℃预变性5min；94℃变性2min，57℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环, 72℃延伸10min），PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR纯化产物克隆分别至PMD18-T载体，经PCR及相对应的酶切鉴定后，送生物公司测序鉴定，结果与（附：筛选的免疫相关GSP1基因序列）相同。