[发明专利]一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法

权利要求书

1.一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，包括以下步骤：

a：标准曲线的建立步骤：

在建立邻苯二甲酸二环己酯的标准曲线之前，先配制不同浓度的标准品。邻苯二甲酸二环己酯标准液用1-2mL的无水乙醇溶解后，再用比例为1∶6～9的稀释液与无水乙醇混合液稀释一系列的浓度，分别为20ng/mL、10ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.025ng/mL、0.0125ng/mL；竞争时加入这一系列浓度的标准液，测定结果的平均值经过数据处理后绘制成标准曲线；

(1)包被步骤：

用浓度为7μg/mL的邻苯二甲酸二环己酯包被抗原包被96孔酶标板，每孔100μL，放置培养箱37℃温育2h后，取出酶标板，将孔内溶液倒掉，每一次加满洗涤液，静置3-5min，再将其甩干，总共三次；

(2)封闭步骤：

在包被好的酶标准版中加入1％卵清蛋白溶液，每孔150μL，37℃温育30min后，取出同上洗涤3次；

(3)竞争步骤：

每孔加入50μL邻苯二甲酸二环己酯标准溶液和50μL酶标记的邻苯二甲酸二环己酯抗体，37℃下温育3h后，然后同上洗涤；

(4)检测步骤：

加入底物液，并与酶发生反应显示颜色，每孔100μL，37℃下温育30min后，用2mol/L硫酸溶液的终止液停止反应；用多功能酶标仪测定各孔在490nm时的吸光强度；

b：样品的检测步骤

除(3)竞争步骤：每孔加入50μL不同水样样品和50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，然后洗涤，其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

2.根据权利要求1所述的一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，其特征在于：

除(3)竞争步骤：每孔加入25μL水样和25μL邻苯二甲酸二环己酯标准溶液，再加入50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，然后同上洗涤。其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

3.根据权利要求1所述的一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，其特征在于：

所述的邻苯二甲酸二环己酯包被抗原通过以下方法制备：

称取4-氨基邻苯二甲酸二环己酯0.0138g先与0.1mL浓盐酸(12mol/L)，再加0.75mL蒸馏水混合，溶解后，置冰浴中冷至4℃以下，3-8℃下均匀搅拌，滴入1mL 0.1mol/L NaNO₂溶液，加完后继续搅拌30分钟，加1-3mg尿素除去未反应的NaNO₂，此时即为反应液1；

将含40mg卵清蛋白溶于10mL硼酸纳缓冲液，然后逐滴加入上述的反应液1中，并用1mol/L NaOH调节到pH8-9，溶液颜色变成橙红色即可，再继续搅拌4h，得到抗原粗品；

将反应液装入透析袋，置蒸馏水透析5天，每天换水2次，得到邻苯二甲酸二环己酯包被抗原。

4.根据权利要求1所述的一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，其特征在于：

所述的酶标记的邻苯二甲酸二环己酯抗体的制备工序，包括免疫抗原的制备步骤、抗体的制备步骤、酶标抗体的制备步骤：

所述的酶标抗体的制备步骤：

辣根过氧化物酶10mg溶于0.4mL 0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，待溶解后加入25％戊二醛0.1mL，然后37℃温育2h；

再加入0-4℃的无水乙醇2mL，2500r/min离心15min，倾去上清液；

取沉淀以80％乙醇(v/v)4mL混悬，2500r/min离心15min，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出；沉淀用1mL 0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5-1mL邻苯二甲酸二环己酯抗体溶液，放在冰箱内4℃过夜后，加入0.5-2mgNaH₂PO₄，调至溶液pH7-8即可，制备好的酶标抗体放置在4℃保存。

5.根据权利要求4所述的一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，其特征在于：

所述的免疫抗原的制备步骤：

称取4-氨基邻苯二甲酸二环己酯0.0553g先与0.1mL浓盐酸(12mol/L)，再加3mL蒸馏水混合，溶解后，置冰浴中冷至4℃以下，3-8℃下均匀搅拌，滴入4mL 0.1mol/L NaNO₂溶液；滴完后，继续搅拌30分钟，加6-12mg尿素除去未反应的NaNO₂，此时即为反应液1；

将含160mg牛血清蛋白溶于40mL硼酸纳缓冲液(pH9.2)，然后逐滴加入上述的反应液1中，并用1mol/L NaOH调节到pH8-9，溶液颜色变成橙红色即可，再继续搅拌4h，得到抗原粗品；

将反应液装入透析袋中，置蒸馏水透析5天，每天换水2次，得到邻苯二甲酸二环己酯免疫抗原。

所述的抗体的制备步骤

取1mL邻苯二甲酸二环己酯免疫抗原加入3mL0.9％的生理盐水配成浓度为1mg/mL的溶液；

①第一次免疫用等体积的完全弗氏佐剂和1mg/mL的免疫原混匀，当混合后的免疫抗原滴进盛有冷水的烧杯中时，能以油滴状态完整地停留在水面上，而不扩散，说明免疫抗原已经完全乳化，可以进行注射；

②首次注射用含完全弗氏佐剂的免疫抗原进行基础免疫，之后用不完全弗氏佐剂的免疫抗原加强免疫。用剪刀剪去兔背部，酒精消毒，采用背部皮下多点注射的方法，每次背部皮下免疫8～10点，每次注射1mL；

③三周后开始用不完全弗氏佐剂的免疫抗原加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，从第二次加强免疫开始，每次免疫后第7天耳静脉采血，室温放置1h后放入4℃冰箱，1h后离心分离出血清后测血清效价；

④当效价不再变化时，颈动脉采血，血清室温静置0.5-1h，在4℃冰箱静止2h后吸取上层澄清的血清，作为邻苯二甲酸二环己酯抗体。