[发明专利]一种添加中药提取液的茶树菇深层发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种添加中药提取液的茶树菇深层发酵方法。属生物工程技术领域。

背景技术

茶树菇属担子菌纲，粪锈伞科，田菇属，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年来发展起来的一种食用菌新品种。茶树菇营养丰富，蛋白质含量高，含有人体必需的氨基酸，并且有丰富的B族维生素和钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。中医认为该菇性平、甘温、无毒，具有较高的药用价值，有清热、平肝、明目、健脾的功效。其提取物多糖对小白鼠肉瘤S-180和艾氏腹水癌的抑制率高达80-90％，是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。茶树菇以液体发酵进行生产时，在培养基中添加适量的中药，能促进其生长或活性产物的产生。

发明内容

本发明的目的是提供一种添加中药提取液的茶树菇深层发酵方法。

本发明的技术方案为：将茶树菇子实体通过组织分离法接入固体斜面培养基上培养，待长好后移至摇瓶种子液体培养基中培养，将培养好的种子液接入添加了刺参水提液的摇瓶发酵液体培养基培养。发酵结束后，离心获得湿菌丝体，部分烘干至恒重后称重。部分湿菌丝体经过匀浆，热水浸提，上清液浓缩，乙醇沉淀，脱蛋白，脱色，透析后冷冻干燥得到茶树菇胞内粗多糖。比较中药材添加前后菌丝体和胞内粗多糖产量的差异(结果见表1)。

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实例一

1.菌种培养

出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；

(1)组织分离法

斜面培养基：PDA培养基，含1.5％～2.0％琼脂，pH自然；

组织分离方法：将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，pH自然，置于25℃温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；

(2)摇瓶种子培养

摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0；

培养方法：从斜面菌种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d；

(3)中药水提液的制备

称取刺参(已切片)10g，加5倍量水浸泡1h，用电炉煎熬至温和的沸腾状态保持30min，倒出药汁，残渣补加适量冷水，再煮沸20min，倒出药汁。合并药汁，过滤，浓缩后用于茶树菇深层培养。

(4)摇瓶发酵培养

发酵培养基：玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL；

培养方法：将培养好的种子以15％的接种量分别接入未添加和添加了刺参水提液50mL的100mL摇瓶发酵培养基中25℃，150r/min，振荡培养7d；

培养结束后离心获得湿菌丝体，取部分烘干至恒重后称重得到菌丝体产量。

2.胞内粗多糖的提取

湿菌丝体经过匀浆，热水浸提，提取温度80℃-90℃，加水量为4倍体积湿菌丝体，总提取时间为10h，提取3次，提取液浓缩后加入3倍体积95％乙醇在4℃醇析。8000rpm离心得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后按多糖溶液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。然后在上清液中加入95％乙醇置4℃冰箱过夜，次日离心收集沉淀。沉淀物用蒸馏水复溶后将5％的多糖溶液用NaOH调pH至9.0，然后滴加20％的H₂O₂(用量为多糖溶液体积的15％)，保持PH8.0-9.0，4h后终止反应，加入95％乙醇置4℃冰箱过夜，次日离心收集沉淀。沉淀物用蒸馏水复溶后取50mL装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次。冷冻干燥后得到茶树菇胞内粗多糖。称重后计算多糖产量。

表1刺参水提液对茶树菇菌丝体和胞内多糖产量的影响