[发明专利]一种将穿梭质粒导入嗜醋酸棒杆菌的电转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种将生物材料导入已知微生物宿主菌载体获得重组质粒的方法，具体涉及到一种将重组穿梭质粒导入嗜醋酸棒杆菌的高效电转化方法。

背景技术

嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)，属于棒杆菌属，常用于发酵生产各种氨基酸。国内嗜醋酸棒杆菌的选育工作仍以传统诱变为主，如化学诱变、物理诱变等筛选营养缺陷型和结构类似物抗性突变株。通过传统诱变方法尽管也获得了不少优良的氨基酸生产菌株，但盲目性高、工作量大，且存在突变株生理失调、易退化等局限性。由于嗜醋酸棒杆菌在工业生产中的重要性，随着分子克隆技术的成熟，对嗜醋酸棒杆菌进行基因工程改造是必然趋势，而通过基因工程改造的一个关键步骤，是建立有效的外源基因转化方法。

国内外目前利用基因工程手段改造嗜醋酸棒杆菌还比较少见，一个重要原因是：棒状杆菌属中，谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌的工业化应用较早。早在2003年，谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组测序工作已经完成。同时，异源质粒整合到谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌的效率远高于嗜醋酸棒杆菌。所以人们往往把目光集中在转化效率更高的谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌。但是嗜醋酸棒杆菌在氨基酸生产工业中有着不可代替的作用，同时嗜醋酸棒杆菌无法通过制备感受态导入外源DNA，必须通过电转化等方法将外源DNA导入到嗜醋酸棒杆菌中，以构建重组菌。因此，提高嗜醋酸棒杆菌电转化效率尤其重要。目前，国内外尚未有文献和专利报告过将穿梭质粒电转化导入嗜醋酸棒杆菌的方法。

发明内容：

针对目前在大肠杆菌和嗜醋酸棒杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入到嗜醋酸棒杆菌的过程中，细胞壁肽聚糖层紧密且厚实，而且还受到嗜醋酸棒杆菌自身的限制性内切酶识别并破坏重组质粒，很难获得重组菌。

本发明的目的是将一种能在大肠杆菌和嗜醋酸棒杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入到嗜醋酸棒杆菌的快速有效的方法。即

本发明提供一种特殊的大肠杆菌大量扩增重组质粒。

本发明提供一种专门的培养基进行前培养。

本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌用氨苄青霉素进行前处理的方法。

本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌电击时加入电击缓冲液的方法。

本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌进行电击后热激处理的方法。

本发明提供一种特殊的大肠杆菌大量扩增重组质粒，即利用大肠杆菌SCS110大量扩增重组质粒，由于SCS110为甲基化酶缺陷型菌株，因此在SCS110大肠杆菌内大量扩增的穿梭质粒不被甲基化修饰。由于棒状杆菌的限制性内切酶系统可识别并降解经大肠杆菌甲基化后的穿梭质粒，因此利用甲基化酶缺陷型大肠杆菌SCS110来源的穿梭质粒做电转化，可提高转化率。

本发明提供一种专门的培养基进行前培养，培养基配方：

通过将嗜醋酸棒杆菌在上述培养基培养过程中，吐温80可改变肽聚糖层外的棒状霉菌酸的碳链长度和不饱和度，甘氨酸代替D-丙氨酸结合到嗜醋酸棒杆菌细胞壁上，削弱肽聚糖链间交联，使得嗜醋酸棒杆菌细胞壁内外层结构均遭到破坏，不完整的细胞壁使得穿梭质粒能够顺利地穿越细胞障碍进入细胞。

本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌用氨苄青霉素进行前处理的方法，即用终浓度0.5-2μg/ml的氨苄青霉素处理30-150min，破坏嗜醋酸棒杆菌细胞壁结构，使菌体细胞壁形成小孔，抑制嗜醋酸棒杆菌细胞壁对穿梭载体的阻碍作用，使该穿梭质粒能够通过电转化方法有效地导入嗜醋酸棒杆菌中。

本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌电击时加入电击缓冲液的方法，即在电击时加入电击缓冲液，电击缓冲液配方：0.5M KCl，0.15M CaCl₂，0.25M MgCl₂。K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺这几种带正电荷配体，均可与带负电荷的细胞膜结合，从而促进细胞膜的击穿，使得外源质粒更容易进入细胞内。

本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌进行电击后热激处理的方法，即将感受态细胞电市后于46℃水浴6min，然后于30℃水浴1h，结束后离心浓缩菌体并涂布至含25μg/ml卡那霉素LB固体培养基中。热激处理步骤可以使嗜醋酸棒杆菌的限制性系统失活。

通过以上技术发明，可到达如下效果：