[发明专利]一种人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒。

背景技术

人胰岛素样生长因子Ⅱ(Insulin-Like Growth FactorⅡ，IGFⅡ)是有67个氨基酸的单链多肽，分子量7Kd，结构与胰岛素相似，大部分经肝脏合成，主要存在于血液中，通过与靶细胞表面的受体特异性结合而发挥促进细胞繁殖、分化、生长、代谢等多种生物效应。近几年来大量研究显示，胰岛素样生长因子Ⅱ具有促进细胞增殖及恶性转化的作用，是一种细胞增殖调控因子，人类多种恶性肿瘤肝癌、胃癌、结肠癌等的发生、发展与胰岛素样生长因子Ⅱ基因调控异常有关。目前国内还没有人胰岛素样生长因子Ⅱ的酶免疫分析相关方法学检测和试剂盒的研究使用报道。北京北方生物制品研究所有人胰岛素样生长因子Ⅱ放射免疫分析的试剂盒，但因为标记物为放射性125I，在使用中存在污染和辐射的缺点；国外有人胰岛素样生长因子Ⅱ的ELISA试剂盒，但价格昂贵。因此，建立一种方便灵敏特异准确的检测方法，从而能为临床和实验室继续探讨胰岛素样生长因子Ⅱ在炎症、肿瘤、肿瘤治疗后效果观察及早期诊断方面提供一个新的思路，提供一种可靠的手段是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒，检测血清中人胰岛素样生长因子Ⅱ的水平。

在生理状态下，血清中IGFⅡ含量甚微且由于分子量小较难获得高效价抗血清，因此发明人用人胰岛素样生长因子Ⅱ多肽连接生物大分子甲状腺球蛋白，连接后将其用微量多次免疫法免疫大耳白兔获得高效价高亲和力的抗血清。用该抗血清包被聚苯乙烯酶标板制成固相化抗体板。用胰岛素样生长因子Ⅱ多肽连接生物素，将生物素化的胰岛素样生长因子Ⅱ与样本中待测胰岛素样生长因子Ⅱ同时等体积加入固相抗体板中，经过反应洗涤后再加入酶标亲和素，经过反应洗涤后加入酶底物经过显色判断待测物中胰岛素样生长因子Ⅱ的含量。

一种人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒由固相酶标板、人胰岛素样生长因子Ⅱ抗体、人胰岛素样生长因子Ⅱ标准品、生物素化人胰岛素样生长因子Ⅱ、亲和素标记的辣根过氧化物酶和辅助试剂组成。

所述人胰岛素样生长因子Ⅱ抗体是由人胰岛素样生长因子Ⅱ连接甲状腺球蛋白后免疫动物获得抗血清，经过饱和硫酸铵分级纯化得到。

其特征在于，所述动物为羊、兔或鼠。

所述人胰岛素样生长因子Ⅱ连接甲状腺球蛋白的方法为戊二醛法。

所述生物素化人胰岛素样生长因子Ⅱ的制备方法如下：将人胰岛素样生长因子Ⅱ加入到0.1mol/L pH 9.2的碳酸盐缓冲液中，在磁力搅拌下，吸取活化生物素溶液加入人胰岛素样生长因子Ⅱ溶液中，室温搅拌2h，24h后将其用生理盐水透析12h，间隔换液4次，将反应物移至离心管高速离心，取上清加入等体积甘油，-20℃保存。

所述辅助试剂包括：显色液、反应终止液、底物工作液、洗涤液和缓冲液。

本发明的有益效果：用本发明的试剂盒检测150份正常献血员和180份肝癌介入前和介入后患者血清，发现正常献血员血清IGFⅡ水平明显低于肝癌各组患者，P＜0.05；肝癌患者进行介入治疗3天后IGFⅡ水平明显低于治疗前，P＜0.05；介入治疗后3天与治疗后一个月水平相比无明显差异。表明该试剂盒可灵敏检测血清中IGFⅡ水平的差异。

附图说明

图1为IGFⅡ酶联免疫分析标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

实施例1人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒的制备

1、材料

免疫用大耳白兔3只，雄性，体重1.5公斤，由301医院动物实验中心提供。人IGFⅡ多肽购于北京博奥森生物科技有限公司，人胰岛素样生长因子Ⅱ标准品购自sigma公司。

2、人胰岛素样生长因子Ⅱ抗体的制备和纯化

将IGFⅡ与甲状腺球蛋白(TG)按最优分子比(1∶100)投料，采用戊二醛法连接，经透析后分装、冷冻干燥备用，制得IGFⅡ-TG。