[发明专利]一种蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片的PCR鉴定方法

说明书

技术领域：

本发明属于食品检测技术领域，具体地涉及一种蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片的PCR鉴定方法。

背景技术：

从生物学分类上讲，金枪鱼指鲈形目(Perciformes)鲭科(Scombridae)金枪鱼属(Thunnus)的共计8种鱼类。经济价值较大的种类包括蓝鳍金枪鱼(Thunnus maccoyii)、大目金枪鱼(Thunnus obesus)、黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)、长鳍金枪鱼(Thunnus alalunga)等，其中蓝鳍金枪鱼、大目金枪鱼、黄鳍金枪鱼是国内生鱼片最常见的原料鱼。

金枪鱼肉质柔嫩鲜美，高蛋白低脂肪，含有多种人体必需的氨基酸，还含有微生素、丰富的铁、钾、钙、碘等多种矿物质和微量元素。金枪鱼中不饱和脂肪酸DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)的含量居各种食物之首。DHA被人们称之谓脑黄金，是人类大脑和中枢神经系统发育必需的营养素。EPA又称OMEGA3，是金枪鱼所特有的营养物质，可抑制胆固醇增加和防止动脉硬化，对预防和治疗心脑血管疾病有着特殊的作用。鉴于金枪鱼的种种优点，目前金枪鱼的消费量逐年增大，其中生鱼片是金枪鱼的最重要的消费方式。蓝鳍金枪鱼由于捕捞量稀少，因而其经济价值较高，蓝鳍金枪鱼是黄鳍金枪鱼和大目金枪鱼价格的两倍之多，然而生鱼片缺乏外部形态学特征，不易鉴定其物种来源，不法商家以次充好，以低价值金枪鱼生鱼片冒充高价值金枪鱼生鱼片，以获取暴利，扰乱了市场秩序，破坏了商业诚信，损害了消费者利益，因此急需针对上述三种金枪鱼生鱼片建立快速、准确的鉴定方法。

生命条形码技术是物种鉴定常用的一项技术，该技术利用一段被称作DNA条形码(DNA Barcoding)的序列，通过PCR扩增、测序分析，进行物种鉴定。对于大多数物种而言，标准的DNA条形码是细胞色素C氧化酶亚基I基因(COI)的一个约650bp左右的片段，该片段在种内保守，在种间变异程度大，所以可以用来进行物种鉴别。但由于金枪鱼的分类比较复杂，该技术目前仅能对蓝鳍、黄鳍、大目金枪鱼生鱼片来源鱼进行属(Genus)的鉴定，不能准确进行种(Species)的鉴别。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片来源鱼品种的PCR鉴定方法，针对目前市场上以黄鳍金枪鱼和大目金枪鱼生鱼片假冒蓝鳍金枪鱼生鱼片的行为，解决金枪鱼生鱼片来源鱼的品种难以鉴别的问题。

本发明在DNA条形码技术的基础上，通过大量DNA序列数据模拟与实际样本分析，确定了上述三种金枪鱼COI基因中的种特异性核酸位点，从而为蓝鳍、黄鳍、大目三种金枪鱼生鱼片的鉴别提供了快速准确的技术方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片来源鱼品种的PCR鉴定方法，包括以下步骤：

1)提取金枪鱼生鱼片DNA；

2)以提取的DNA为模板，以F1/F2为引物，PCR扩增COI基因片段，其中F1：5-CACAAAGACATTGGCACCCT-3；

F2：5-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3；

3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，将650bp的目的条带切下纯化，将纯化后的PCR产物测序；

4)PCR产物测序结果通过NCBI网站在线提供的BLSAT软件，确定金枪鱼生鱼片来源鱼的属(Genus)；

5)确定属(Genus)后，再通过分析COI扩增片段的种特异性核酸位点确定金枪鱼生鱼片来源鱼的品种(Species)，即蓝鳍金枪鱼的COI基因扩增片段的第337个碱基为胸腺嘧啶T，第508个碱基为鸟嘌呤G，大目金枪鱼和黄鳍金枪鱼在上述两个位点均为胞嘧啶C；大目金枪鱼COI基因扩增片段的第400个碱基为胞嘧啶C或者鸟嘌呤G，蓝鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼鱼在该位点均为胸腺嘧啶T。

进一步，所述的PCR反应条件为：

进一步，所述的琼脂糖凝胶电泳检测所用的凝胶浓度为0.8％。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明从分子水平对金枪鱼生鱼片来源鱼的品种进行鉴定，更加准确，为打击假冒伪劣行为，维护市场经营秩序提供了有力的技术支撑。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步解释。