[发明专利]增强子Hr3在促进hycu-ep32蛋白增量表达中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因领域，特别涉及家蚕的转基因技术。

背景技术

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。转基因技术是现代生物学研究中的一项重要的技术，在功能基因研究、生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，蚕丝业每年为蚕农创收 100 多亿元，蚕丝业为世界经济、文化、社会发展作出了重要贡献。但是，当家蚕遭遇病毒侵害，通常会造成蚕业的巨大损失。据统计，我国养蚕业最为发达的几个主产区，每年因病毒性疾病所造成的损失，约占总蚕病损失的 70-80%。其中家蚕核型多角体病毒病又是三大病毒病中最常见﹑危害最严重的一类蚕病,该病传染性极强，难以控制。

引起核型多角体病毒病的病原为家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,BmNPV), BmNPV属于杆状病毒科，真杆状病毒亚科,核型多角体病毒属,病毒粒子呈杆状，全基因组大小为128413bp；病毒结构主要由外层的囊膜和内层的核衣壳组成，在不同感染时期分别以出芽型病毒粒子(budded virus,BV)和包埋型病毒粒子(occluded virus,OV)两种形态存在，而多角体是在感染细胞的核或质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶，很稳定。多角体病毒对不良环境﹑消毒药剂等有较强的抵抗性，在环境中可以长期存活，但极易溶于碱性溶液；当家蚕食下多角体病毒，在中肠强碱性消化液(pH9.2～9.4)作用下多角体被溶解，释放的病毒粒子OV借囊膜与中肠上皮细胞微绒毛膜的融合作用脱去囊膜，核衣壳进入中肠细胞开始原发感染(Primary infection)，在细胞内复制核衣壳并通过“出芽”方式产生BV进入血体腔，继而感染其他组织细胞。最终，蚕体多以体壁破裂，流出病毒多角体浓汁而死。病毒多角体浓汁中含有大量的病毒粒子，污染蚕座环境，使得周围健康蚕感染病毒。可见，家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产中的一个重要的危害原，一旦产生，极易爆发。

由于家蚕核型多角体病毒病在蚕业生产中危害重大，蚕业界一直希望能够培育出对此病毒具有较高抗性的蚕品种。但是，由于目前病毒致病分子机制研究较少，加之抗性品种培育手段多采用传统的遗传筛选的办法，周期长而且定向性差，所以收效甚微。

转基因技术在生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用，自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。目前已经有报道外国学者尝试通过转基因干涉病毒基因的方法来提高家蚕的抗性，他们利用的是家蚕多化性品系的非滞育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵，其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制。但是，通过转基因干涉利用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系具有以下两个方面明显的缺陷：①生产用种普遍为二化性滞育种，用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系不利于生产推广，同时与滞育性的家蚕品种相比较，多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖，这样需要耗费大量的人力物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。②转基因干涉品系只能在mRNA水平发挥作用，不能在病毒DNA复制和蛋白合成水平发挥作用。因此，利用家蚕滞育品种，制备一种能在病毒DNA复制和蛋白合成水平抑制病毒增殖的转基因品系是一个有效可取的方法。

先前的研究结果显示，当家蚕核型多角体病毒（BmNPV）和美国白蛾核型多角体病毒（HycuNPV）共转染BmN-4细胞，BmNPV在BmN-4细胞中的增殖将受到抑制，HycuNPV编码的hycu-ep32基因与BmNPV的增殖被抑制有关。家蚕自身抗性的有限导致宿主对抗性蛋白的大量需求。然而，遗憾的是，家蚕自身体内并不存在Hycu-EP32 蛋白。BmNPV的同源重复区(homologous regions，hr3)具有复制起始位点的功能，可以对启动子行使增强子功能。在细胞水平，Hr3增强子能使启动子的活性增强几倍，而Hr3+BmNPV的IE1蛋白能使启动子的活性增强上千倍。BmNPV的39kP启动子具有明显的BmNPV诱导启动活性，能使家蚕在受到BmNPV侵染的时候启动下游基因的表达。