[发明专利]一类基于三嗪结构的糖标记试剂及其合成方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一类基于三嗪结构的糖标记试剂制备及其在毛细管电泳质谱连用技术(CE-MS)中的检测应用。

背景技术

糖是组成生命体最基本的四种生命分子中的一大类。广泛存在于人体内，据估计人体70％以上的蛋白均为糖基化的蛋白。蛋白的糖基化在蛋白质结构和功能的调节上起着非常关键的作用。糖基化水平的改变通常是蛋白结构与功能变化的标志。因此糖的研究得到来自临床和生物制剂领域的极大关注。

由于绝大部分的糖都没有可以用于检测的生色基团，因此难以用光学手段进行检测，同时大部分的糖很难离子化，因此质谱的检测也存在着相当大的困难。为了解决这些问题，在过去的几十年里，多种基于不同检测手段(紫外可见，荧光等)的糖标记试剂被开发出来。

CE-MS(毛细管电泳-质谱连用)在分析水溶性的极性样品上具有高效液相色谱质谱连用技术所不具备的优势，其具有样品消耗小，分离效率高，同时定性能力强的特点。因此该技术有潜力成为对于糖类样品分析的理想方法。然而由于一直没有适合于该方法的糖类标记试剂，从而在很大程度上限制了这一技术在糖类分析中的进一步发展。

发明内容

本发明的目的在于提出一类基于三嗪结构的糖标记试剂及其合成方法和应用。

本发明提供的一类新型糖标记试剂为3种不同取代的三聚氯氰T1/T2/T3，其结构式分别为：

T1的结构式：

T2的结构式：

T3的结构式：

本发明基于三嗪结构的糖标记试剂的合成方法，具体包括：

T1合成方法：

2-氯-4，6-二甲氧基-s-三嗪溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取若干次，浓缩。

T2合成方法：

将三聚氰氯溶于一定量甲醇，加入过量碱，在冰浴条件下搅拌反应过夜，层析色谱监控至反应完全。待反应完全后，将反应溶液倒入冰水混合物中，搅拌，过滤，用水洗涤至无氯离子，真空干燥，得到白色粉末。

将上一步产物溶于一定量有机溶剂(二氯甲烷/乙腈/四氢呋喃)，加入过量三级胺(N，N-二异丙基乙胺/三乙胺/吡啶/咪唑)，室温下加入当量二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-过夜。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩。

上步产物溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取若干次，浓缩。

T3合成方法：

三聚氰氯溶于一定量有机溶剂(二氯甲烷/乙腈/四氢呋喃)，加入过量三级胺(N，N-二异丙基乙胺/三乙胺/吡啶/咪唑)，在室温下加入过量二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-过夜。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩。

上步产物溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取若干次，浓缩。

本发明提供基于该类糖标记试剂的多糖标记方法，包括：

T1标记方法

将过量的标记试剂T1加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1～1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。

T2标记方法

将过量的标记试剂T2加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1～1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。

T3标记方法

(1)非还原条件下的标记反应

标记反应如下所示：

(a)针对水溶性糖类样品