[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速检测试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速诊断试纸条，属于一种新的动物诊断试剂，主要用于诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的动物；应用于畜牧兽医学领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起，主要特征为怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪的呼吸道疾病。PRRS是上世纪80年代后期暴发的一种新的传染性疾病，于1987年首发于北美地区，在随后的几年内，便迅速地在欧、美大陆的许多国家流行，随后又蔓延至亚洲的一些国家，成世界范围内的大流行，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。我国自1995年底暴发此病，并迅速传播至全国各地，成为我国规模化养猪场引发繁殖障碍的主要疫病之一。近年来PRRS呈持续性感染，并导致继发性感染增加，严重威胁了养猪业的发展。

目前猪繁殖与呼吸综合征病毒病检测主要采用的技术方法有：ELISA、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、免疫荧光技术、荧光RT-PCR、环介导逆转录等温检测(RT-LAMP)、基因芯片以及病毒的分离鉴定等。比较快速准确的技术是ELISA和荧光RT-PCR，但这2种技术都需要特殊的仪器设备，并且检测时间都在2小时以上，检测成本昂贵，不便于适时和快速诊断。这些限制了猪繁殖与呼吸综合征病毒病的预防控制，因此研制出一种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。

发明内容

发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法,该方法是利用基因工程表达猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白,利用免疫学抗原抗体能特异性结合原理，胶体金标记抗原与抗体结合,快速检测猪血液或血清中与病毒复制相关抗体；该测试纸条可广泛用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测；与其他病毒无交叉反应,与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为95.3％和93.12％。与ELISA相比,重组抗原免疫胶体金具有明显的优势：安全性好,无需培养病毒本身,避免了因操作病毒造成的病毒扩散；可以大批量制备,工艺简单,生产成本低廉；抗原成分稳定均一,操作简便省力,不用仪器,检测结果特异性高,重复性好。整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。

本发明的技术方案是这样实现的：一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于：试纸条由样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)依次粘附在不吸水的支撑薄片(5)上；其中结合垫(2)上包被有胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9重组蛋白；硝酸纤维素膜(3)上分别包被SPA构成的检测线T线(6)和抗Nsp9蛋白单克隆抗体IgG构成的质控线C线(7)。

所述的结合垫(2)上包被的胶体金标记的猪繁殖与呼吸病毒Nsp9蛋白的制备方法如下：(1)首先利用基因工程菌原核表达Nsp9蛋白，所制备抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白，且为病毒特有蛋白，这就决定了试纸条的特异性；

(2)将纯化的PRRSV Nsp9蛋白制备金标抗原，用0.1M碳酸钾调胶体金的PH值至8.2，按100ug /毫升胶体金加入Nsp9蛋白,磁力搅拌器混匀30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置1小时。4℃ 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4℃备用。

(3)将结合垫浸泡于封闭液即2% BSA、0.5%吐温-20、2.5%蔗糖、0.05%叠氮钠、0.01M PBS中30分钟，37℃烘干；然后将制备好的金标抗原均匀喷涂于结合垫上，每毫升铺20平方厘米，冻干、保存。

所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的检测线T线(6)是选用一种能够与IgG分子Fc片段特异性结合的蛋白(SPA)喷涂于检测线上，用包被缓冲液将SPA稀释到50ug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫一端约5mm。