[发明专利]猪传染性胃肠炎S/N蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗原融合基因以及含有该抗原融合基因的重组菌株，尤其涉及猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白融合基因以及含有该融合基因的表达载体，本发明进一步涉及含有该表达载体的重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株以及它们在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途，属于猪传染性胃肠炎的防治领域。

背景技术

猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)所引起的以严重腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。TGEV主要存在于空肠和十二指肠，各种日龄的猪均易感。由于仔猪自身抵抗力比较差，易受外界各种刺激因素的影响和病原微生物的侵袭，常会因严重脱水而发生死亡，并以2周龄以内的仔猪死亡率最高，可达100％。随日龄的增大，虽然死亡率逐渐下降，但感染该病的猪生产性能下降，饲料报酬率低，给世界范围内的养猪业都带来严重的经济损失。猪传染性胃肠炎病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗TGEV感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。

常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治这两种疾病中起到了积极作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些问题，如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外必须通过注射途径免疫。针对本病的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，但是如何避免胃肠道对抗原的破坏并有效诱导免疫应答成为技术的关键。TGEV有三种主要结构蛋白，分别为磷酸化的核衣壳蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纤突蛋白S，其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定族，并且可以介导细胞的吸附、中和抗体的产生等过程，可以提供有效的免疫保护作用。

TGEV感染具有明显的嗜肠性，病毒粒子表面的纤突蛋白(S蛋白)与存在于肠上皮细胞顶膜的氨基肽酶(APN)的结合是感染发生的首要条件，粘膜免疫是本病特异性免疫应答的主要特征，肠道粘膜表面SIgA含量的高低直接决定临床疾病的发生和疾病严重程度。

针对猪传染性胃肠炎发病的几个特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径。口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能。使用细菌病毒等活载体来传递完整无损的抗原成分解决了这个问题，目前有使用减毒细菌作为疫苗抗原的载体的报道，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙门氏菌作为载体传递DNA疫苗可能存在毒力返强的危险，质粒DNA也可能会整合到宿主细胞基因组，引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原融合基因及其编码的蛋白；

本发明的目的之二是提供含有上述猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原位点的融合基因的表达载体；

本发明的目的之三提供含有上述表达载体的重组宿主菌株。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种由猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中A、D抗原位点和N蛋白中的N₃₂₁抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWA_M6)连接得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明将TGEV S蛋白中A、D抗原位点(Sad)和N蛋白中的N₃₂₁抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWA_M6)(以化脓链球菌M6蛋白的最后140个氨基酸为细胞壁锚定序列)连接起来，考虑到乳酸乳球菌使用密码子的偏嗜情况，为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子丝氨酸(TCG)、苏氨酸(ACG)、脯氨酸(CCC)、精氨酸(CGG)、苯丙氨酸(TTC)等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。对A抗原位点上的3个甲基化位点(AAC-AAT，ATC-ATT，ACA-ACT)进行点突变，但不改变其所编码的氨基酸。通过两个柔性的Linker((GGGGS)₃)将TGEV的A、D抗原位点基因和N₃₂₁抗原位点基因连接起来(顺序为D-Linker-N₃₂₁-Linker-A)，并把该序列命名为MLSN(SEQ ID No.1)；此外，在MLSN的上游和下游分别引入NcoI酶切位点和SacI酶切位点。