[发明专利]一种锦鲤鳍条组织细胞系及构建方法

权利要求书

1.一种分离的锦鲤鳍条组织细胞系，其特征在于：锦鲤鳍条组织细胞系Koi-Fin，CCTCC NO: C201199。

2.权利要求1所述的一种锦鲤鳍条组织细胞系的构建方法，其步骤是：

A、锦鲤鳍条组织块的制备：将锦鲤放置在浓度为15-25克/升的高锰酸钾溶液中，消毒处理30-40 min后再用70%V/V酒精擦拭鱼体表面，在柜里无菌取出背鳍、腹鳍组织，用含450-550单位/毫升青霉素、450-550微克/毫升链霉素、12.0-13.0微克/毫升两性霉素B的磷酸缓冲液洗涤鳍条组织3～4次，用灭菌的眼科剪子将鳍条组织剪成1 mm³的碎块，均匀移植到25毫升细胞培养瓶里，于23-25℃培养箱里倒置干贴1.5-2.5 小时；

B、锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液的配置：取6.8-7.2毫升pH值为7.0-7.4的MEM培养基，加入1ml胎牛血清，在培养液中添加0.01‰-0.02‰W/V的成纤维细胞生长因子、0.01‰-0.02‰W/V表皮细胞生长因子；

C、锦鲤鳍条组织细胞的原代培养：将每瓶干贴后鳍条组织中添加专用增殖培养液，于23-25℃培养箱里培养，细胞从鳍组织周围迁出后，每隔3-5天半量更换锦鲤鳍条组织专用增殖培养液，即用移液管从每个细胞培养瓶里吸出2.5ml培养液，去除未贴壁的组织块以及死细胞，并添加2.5ml新鲜的锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液；

D、锦鲤鳍条组织细胞的传代培养：待锦鲤鳍条组织细胞长成单层后，用移液管吸弃旧培养液，向每个细胞培养瓶里添加2毫升浓度为0.25-0.4%W/V的胰蛋白酶消化液静置消化2分钟，待细胞解离后，每瓶加入2ml锦鲤鳍条组织细胞专用培养液，吹打细胞；将细胞悬液吸至15毫升离心管里，1000转/分钟、离心5分钟；吸弃离心管里上清液，添加5ml锦鲤鳍条组织细胞专用培养液，用移液管吹打细胞沉淀，制成细胞悬液，每个细胞培养瓶里添加2.5毫升细胞悬液和2.5毫升锦鲤鳍条组织细胞增殖培养液；待锦鲤鳍条组织细胞再次形成单层后，按照上述的锦鲤鳍条组织细胞的传代培养方法进行下一次传代培养。