[发明专利]一种产尸胺工程菌

说明书

技术领域

本发明属于基因工程菌领域，尤其是一种产尸胺工程菌。

背景技术

尸胺(Cadaverine)是一种多胺，即1，5-戊二胺(简称戊二胺)，在生物体内由赖氨酸脱羧生成，是广泛存在于生物体中的具有生物活性的含氮碱，但也作为一种肉毒胺存在于腐败物中。尸胺是合成新型材料聚酰胺-54(由尸胺和琥珀酸缩合而成)和聚酰胺-56(由尸胺和乙二酸缩合而成)的重要原料，具有重要的工业用途。

目前合成尸胺的方法有化学合成法和酶转化法。化学合成法条件苛刻、污染环境，酶转化法过程复杂、成本较高。利用基因工程技术构造代谢工程菌来直接规模化制备人类所需产品是最经济、环保和最有前途的方法，是代谢工程研究的方向和热点。

微生物发酵法生产尸胺就是微生物利用糖类进行发酵，通过代谢直接大量合成尸胺，这种方法简单、经济、环保和高效，但要求微生物既能高效合成L-赖氨酸脱羧酶，又能高效合成L-赖氨酸，同时还能将尸胺转运到培养基中，防止尸胺对赖氨酸脱羧酶产生竞争抑制。虽然大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等可以直接合成尸胺，也对尸胺合成调节进行了广泛研究，但这些菌不能大量合成赖氨酸，尸胺合成量低，不适合直接发酵生产。谷氨酸棒杆菌能大量合成L-赖氨酸，但不能合成赖氨酸脱羧酶，也不能转运尸胺，给发酵制备尸胺带来了一定困难。随着基因工程技术迅猛发展和谷氨酸棒杆菌表达系统不断完善，在谷氨酸棒杆菌中高效表达大肠杆菌L-赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-尸胺转运蛋白，有效控制赖氨酸合成的代谢过程，大量合成尸胺已成为可能。

发明内容

本发明在于克服现有技术的不足之处，提供一种产尸胺工程菌，通过构建产尸胺工程菌来发酵生产尸胺，将赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因导入到谷氨酸棒杆菌中进行共表达，赖氨酸脱羧酶将赖氨酸转化为尸胺，赖氨酸-尸胺反向转运蛋白CadB将细胞外的赖氨酸转运至细胞内，为尸胺提供合成底物，同时将合成的尸胺转运至细胞外。

本发明实现目的的技术手段如下：

一种产尸胺工程菌，所述工程菌具有赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因。

而且，所述工程菌宿主菌为谷氨酸棒杆菌。

而且，所述赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因对所述工程菌是异源的。

而且，所述赖氨酸脱羧酶基因来源于蜂房哈夫尼菌、大肠杆菌。

而且，所述赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因来源于大肠杆菌。

而且，所述赖氨酸脱羧酶基因大小为2220bp，其序列为序列1；所述赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因为1335bp，其序列为序列4。

而且，所述赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因以单顺反子的形式共表达，或者赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因以多顺反子的形式共表达。

而且，所述共表达的赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因可以同时整合到宿主细胞的基因组中，或者同时存在于宿主细胞内的共表达载体上，或者一个基因整合到宿主细胞的基因组中，另一个基因存在于宿主细胞内的表达载体上。

本发明的优点和积极效果：

1、本发明将赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因转入能够大量合成赖氨酸的谷氨酸棒杆菌中，构建工程菌株，实现赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白cadB基因的高效表达，进而达到尸胺的过量合成，为微生物发酵法批量生产尸胺提供了有效途径，为新型材料聚酰胺的生产提供了原料，有效遏制全球变暖。

2、本发明合成尸胺的方法简单、经济、环保、高效，符合当前化学产品进行生物合成的发展趋势，不仅具有较强的基础理论研究价值，而且具有巨大的经济效益和实惠效益，市场开发前景广阔。

附图说明

图1a为本发明的扩增电泳图，其中：1、PCR获得的赖氨酸脱羧酶基因；M、1kb DNA Marker；

图1b为重组质粒pXMJ19-ldc的酶切验证图，其中：1、pXMJ19-ldc/HindⅢ；2、pXMJ19-ldc/XbaⅠ；3、pXMJ19-ldc/HindⅢ/XbaⅠ；M、1kb DNA Marker；

图2a为本发明的扩增电泳图，其中：123、PCR获得的赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因；M、1kb DNA Marker；

图2b为重组质粒pXMJ19-cadB的酶切验证图，其中：12、pXMJ19-cadB/HindIII/

BamHI；34、pXMJ19-cadB/PCR；M、1kb DNA Marker；