[发明专利]一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及DMD基因的分析及其方法。 

背景技术

DMD基因是迄今为止发现的最大的人基因，该基因有时会发生突变，例如新生男婴中1∶3500出现该基因的突变。DMD基因内一个或多个外显子的大片段会发生缺失，涉及基因近端和中部两个热点区域(外显子3-7和外显子44-55)。DMD基因内一个或多个外显子的大片段会发生重复，约占DMD突变的6％。DMD基因发生更多的是点突变、小片段的缺失和插入。 

目前，DMD基因的检测方法主要有以下几种：微阵列比较基因组杂交技术(a-CGH)、MLPA、MAPH、SCAIP、多重PCR、DNA印迹、Sanger测序法和第二代测序技术。对于高通量检测DMD基因外显子缺失和重复而言，上述这些检测方法的缺点是通量低、效率差。所以，本领域中需要新的高通量检测DMD基因外显子缺失和重复的方法。 

发明内容

本发明涉及一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复方法，所述方法利用现在DMD基因的序列信息设计探针，将捕获富集获得的DNA片段进行测序，通过分析获得DMD基因外显子缺失信息。 

本发明提供了一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复的方法，包括步骤： 

1)将从待测样品和正常对照样品提取基因组DNA分别打断为双链DNA片段，并在所述双链DNA片段的两端添加接头序列； 

2)以第一引物和第二引物扩增所述带有接头的双链DNA片段，获得第一扩增产物； 

3)将所述第一扩增产物变性后，用核酸芯片进行杂交捕获； 

4)以第三引物和第四引物扩增所捕获的核酸，获得第二扩增产物； 

5)对上述第二扩增产物进行测序，获得测序序列片段； 

6)将所述测序序列片段比对到参考DMD基因的外显子序列及外显子侧翼上； 

7)通过比较待测样品和正常对照样品比对结果确定所述待测样品DMD基因的外显子是否有重复和/或缺失，即如果比对到所述基因外显子参考序列上的所述待测样品测序序列显著多于/少于所述正常对照样品测序序列，表示所述基因的外显子是否有重复和/或缺失。 

本发明的方法结合序列捕获技术、高通量测序和生物信息分析对DMD基因进行检测。这三种技术的结合是一种非常有效的DMD基因缺失和/或重复的检测策略。 

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。 

图1显示了用于确定本发明的设截止值的正态分布图。 

图2显示了实施例中的实验上机条件。 

具体实施方式

以下实施更详细的描述了本发明，这些实施例仅为示例性的，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。 

利用目标区域捕获技术，使用外显子捕获芯片对人DMD基因的外显子测序，进而开展DMD基因外显子缺失和重复突变相关研究，目前还是一项新技术。该技术的基本原理是使用一套寡核苷酸探针来捕获基因组上的目标序列，然后使用根据DMD基因基因区序列和/或所述接头序列设计的引物对这些捕获到的序列进行PCR扩增，再对这些扩增产物进行高通量测序，从而识别DNA样品中的碱基序列，通过生物信息分析方法对测序所得序列信息进行分析，从而找到目标序列的变异信息，包括单核苷酸变异、插入/缺失、重复、外显子拷贝数变化等。 

本发明提供了一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复的方法，包括步骤： 

1)将从待测样品和正常对照样品提取基因组DNA分别打断为双链DNA片段，并在所述双链DNA片段的两端添加接头序列； 

2)以第一引物和第二引物扩增所述带有接头的双链DNA片段，获得第一扩增产物； 

3)将所述第一扩增产物变性后，用核酸芯片进行杂交捕获； 

4)以第三引物和第四引物扩增所捕获的核酸，获得第二扩增产物； 

5)对上述第二扩增产物进行测序，获得测序序列片段； 

6)将所述测序序列片段比对到参考DMD基因的外显子序列及外显子侧翼上； 

7)通过比较待测样品和正常对照样品比对结果确定所述待测样品DMD基因的外显子是否有重复和/或缺失，即如果比对到所述基因外显子参考序列上的所述待测样品测序序列显著多于/少于所述正常对照样品测序序列，表示所述基因的外显子是否有重复和/或缺失。