[发明专利]一种金属镉抗性相关蛋白KdpD及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种金属镉抗性相关蛋白KdpD及其编码基因和应用。

背景技术

随着矿产资源的开发利用、工业发展，重金属对环境造成的污染日趋严重，土壤重金属污染已经成为一个危害全球环境质量的问题。土壤重金属会影响植物的生长发育，降低农作物的产量和质量，给农业生产带来了严重的经济损失。此外，受土壤重金属污染的作物在植物体中积累，并通过食物链富集到人体和动物体中，危害人畜健康，引发癌症和其他疾病等。治理重金属污染刻不容缓，各种修复技术和措施正在研究和应用中。各国政府和科学家着力通过两个途径解决这一问题：一为利用物理的、化学的方法试图清除土壤或水体的重金属污染：二为利用现代生物技术清除污染。自从20世纪80年代以来，生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的广泛关注。生物修复一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型，其中植物修复和微生物修复是研究的热点。微生物修复就是利用微生物将环境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程。近年来，基于微生物对重金属的作用机理，以修复有毒有害金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日趋成熟。植物修复指利用植物去治理水体、土壤和底泥等介质中的污染的技术。然而用于重金属污染修复的生物往往会受到重金属的毒害，生长缓慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金属对植物和微生物的毒害作用是生物修复的主要限制因素。

解决生物修复中重金属对生物的毒害作用的根本途径在于研究耐受重金属的分子生物学机制，克隆对重金属耐受的关键基因，通过基因工程手段获得用于生物修复中性能优良的转基因工程生物。

由于技术上的原因，直到最近，对微生物基因资源的利用主要局限于可培养微生物。然而，已培养微生物仅占自然界中微生物的不到1%，因此各种生境中的微生物宏基因组是一个巨大而未发掘的基因资源库。极端环境具有丰富的微生物资源，当中许多与逆境和关键生命过程相关的基因在长期的适应进化中获得了更强的耐性潜能，发掘这些抗性基因已成为国际重要的研究热点。酸性矿山废水(AMD)是极端生境微生物学研究的重要系统。AMD来源于采矿活动使含硫矿物(主要为黄铁矿, FeS₂)暴露于空气和水中，在微生物催化作用下迅速氧化产酸所致，其pH值一般在1~ 4左右，而且富含硫酸盐以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金属，是采矿业面临的最严重环境问题之一。在AMD中生存的原核微生物在长期的进化过程中逐渐形成了一些独特机制，以应对低pH值、高盐度以及高重金属等多种极端环境协迫。因此，AMD生境成为极具特色和丰富的抗逆基因库。

K⁺对于细胞的稳态和细胞内pH的维持，各种酶的激活，基因的表达以及各种胁迫下的应激反应起着非常重要的作用。大肠杆菌中至少有三个K⁺ 吸收系统，其中KdpFABC是可诱导的高亲和的K⁺ 吸收系统，在其它转运蛋白无法满足细胞对K⁺需求时吸收K⁺。KdpD包含两个调节蛋白——膜整合组氨酸激酶KdpD和细胞质响应调节蛋白KdpE。

组氨酸激酶KdpD获知细胞质中K⁺浓度，离子强度，ATP含量等不同的化学信号，调节激酶和磷酸酶活性的比例。一旦激活，KdpD则转换成“开”的状态，其特征在于很高的激酶与磷酸酶的比值。在“关”和“开”的短暂转换过程中，涉及到静电相互作用的变化。KdpD是个二聚蛋白，在转换的过程中，发生自身磷酸化作用。推测在此过程中，细胞质端的结构域稍微有些移动和分开。因此，细胞质中的N-末端结构域变得可接近，并且能稳定磷酸化KdpE和DNA的联系。同时，KdpD将磷酰基团传递给KdpE发生二聚化。

在细胞质膜上，KdpD由固定的四个跨膜结构域组成，同时还有一对较大的N-和C-末端结构域。在C末端上，有非常保守的组氨酸激酶结构域HATPase_c和HisKA，后者包含了自身磷酸化位点His673，其对于自身磷酸化和磷酸盐的转运是不可或缺的. HATPase_c是作为ATP结合结构域。研究表明，KdpD处于功能状态时至少是个二聚物：一个亚基结合ATP在HATPase_c结构域上，另一个亚基在HisKA结构域上发生磷酸化作用。