[发明专利]一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。

背景技术

酶联免疫吸附测试(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。ELISA法作为一种重要的疾病诊断技术，具有成本低，特异性强、灵敏度高，安全无污染等优点，因此被广泛应用于科研及医疗领域。

由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性；而另一方面，又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化第五分子发生反应，产生放大作用，因此，ELISA法具有很高的敏感性。

通常间接法ELISA首先用抗原包被固相载体，然后加入特异性抗体即一抗，使之与固相抗原结合，再加入酶标记的二抗，使之与一抗结合，反应后加入底物显色，颜色的深浅与标本中抗原的量成正比，可通过酶标仪显示具体数据。这一过程有多次洗板操作，难免引起误差，且较耗费时间。因此，在不影响检测范围的前提下，对这一技术进行改进具有现实意义。

目前，改进ELISA的方法很多，主要有以下几点：

对基材的改性，通常采用紫外照射，等离子体处理等方法来处理酶标板表面以提高其对抗原的结合能力，但这些方法都需要特殊设备，成本高，操作较为复杂。

对试剂的优化，以单克隆抗体取代多克隆抗体，以及使用敏感度高的显色体系都可以提高检测的灵敏度，但需要花费大量的人力物力进行研究。

对操作过程的改进，双抗体夹心法一直是ELISA法的经典方法之一，双位点一步法在此基础上改进，大大节约了检测时间，但是对于高浓度的抗原检测，会出现“HOOK”效应(吸光值随浓度增大先升高后明显降低的现象)，造成标本假低值，甚至出现假阴性的错误结果。

因此，需要在准确测量抗原样品浓度的基础上，提供一种简化操作步骤，节约时间、准确度较高的运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。该方法将待测蛋白质的抗体与酶标记抗体混合获得混合抗体，运用ELISA测定蛋白质浓度。本发明提供的方法准确度较高，重现性较好，简化操作步骤，节约测定时间。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法，包括如下步骤：

取待测蛋白质的抗体经第一稀释后获得第一抗体；

取酶标记抗体经第二稀释后获得第二抗体；

取所述第一抗体与所述第二抗体混合获得混合抗体，所述第一抗体与所述第二抗体的摩尔浓度之比为1∶0.0625～1∶2；

取待测蛋白质的标准品获得系列浓度的标准溶液，取所述标准溶液包被基板，第一孵育、洗板、封闭后，加入所述混合抗体，第二孵育后加入所述酶的底物显色，终止反应后，测得吸光度值，获得标准曲线；

取待测蛋白质获得待测溶液，取所述待测溶液包被基板，第三孵育、洗板、封闭后，加入所述混合抗体，第四孵育后加入所述酶的底物显色，终止反应后，测得吸光度值，与所述标准曲线比较，获得所述蛋白质的浓度。

本发明提供的方法中，获得的混合抗体肉眼观察无看见浑浊，在500～600nm检测，吸收峰与混合前所述带测蛋白质的抗体、所述酶标记抗体的吸收峰相比，均未出现明显尖锐的峰，即均无显著变化。因此，本发明提供的混合抗体能够用于ELISA法测定蛋白质含量。

作为优选，所述第一稀释倍数为2500～5000倍。

作为优选，所述第二稀释倍数为300～10000倍。

作为优选，所述第一抗体与所述第二抗体的体积比为1～10∶10～1。

优选地，所述第一抗体与所述第二抗体的体积比为1∶1。

作为优选，所述吸光度值在400～600nm下测定。

优选地，所述吸光度值在405nm下测定。

作为优选，所述第一孵育或第三孵育具体为于30～40℃孵育2～4h。

作为优选，所述封闭加入牛血清白蛋白于30～40℃孵育0.5～1.5h。

作为优选，所述第二孵育或第四孵育具体为于30～40℃孵育0.5～1.5h。

作为优选，所述显色具体为0～30℃显色5～30min。

作为优选，所述待测蛋白质的抗体为所述待测蛋白质的单克隆抗体。