[发明专利]富硒禽蛋中硒形态的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种富硒禽蛋硒形态的测定方法，特别是涉及一种富硒禽蛋进行前处理后进行硒形态的测定方法。

背景技术

硒是人体必需的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的组成成分，具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人体免疫力、保护心脑血管等作用(Rotruck J T，Pope A L，Ganther H E，et al Selenium：biochemical role as a component of glutathione peroxidase.Science，1973，179，588-590.)。我国有2/3的地区缺硒，其中有1/3的地区为严重缺硒地区。人和动物体缺硒会导致克山病，大骨节病，动物的白肌病等，除此以外一些癌症，地方性甲状腺障碍等疾病也与低硒环境密切相关(Ip C.Lessons from basic research in selenium and cancer prevention.Journal Nutrition，1998，128，1845-1854.)。人们日常饮食中的硒包括无机硒和有机硒，其中无机硒毒性较大，中毒量与需要量的界限非常接近，而且吸收和利用率差，生物有效性低，因而被严格限制其使用量。有机硒更利于人体吸收利用，生物活性强，毒性低(卢岚，鲁兵，王春娥.保健食品中有机硒和无机硒的分析探讨.中国卫生检验杂志.2010，20(4)：767-769.)，是更高效、安全的人体补硒形式。硒的生物学功能的发挥主要依赖于其存在形态，特别是有机硒(硒代氨基酸)的形态。因此，准确的检测分析硒代氨基酸的形态具有重大的意义，不仅能指导消费者科学补硒，还能进一步了解硒的生物化学特性和硒在自然界迁移变化的规律。

目前，我国测定有机硒含量的方法主要为差减法(秦昉.植物中有机硒含量的测定.无锡轻工业大学学报.1998，17(4)：74-77.)，差减法的原理是先利用不同的试剂将待测样品中的有机硒和无机硒分离，因无机硒主要以硒酸根(SeO42-)和亚硒酸根(SeO32-)阴离子形式存在，易溶于水。有机硒主要是与蛋白质、纤维素和碳水化合物中的C、N等结合，以大分子的有机物形态存在，所以可利用环己烷或甲苯等有机溶剂萃取出有机硒，再通过测定总硒和无机硒的含量，差减得到有机硒的含量。此方法操作步骤繁琐，重复性差，只能得到有机硒的总量，对于具体的有机硒形态并不清楚，且所用的环己烷、甲苯等有机溶剂存在一定的毒性。硒形态研究属于前沿研究，目前国内、外并无硒形态研究方法的标准。本发明利用温和的提取方式，提取含硒化合物，利用酶水解含硒化合物后再利用液相色谱进行有效分离，最后利用高灵敏度的原子荧光(AFS)进行不同形态硒的测定，最后得到有机硒的含量。此方法的优点是能测定富硒植物中不同形态的硒含量和有机硒含量，能进一步了解植物富集吸收硒的转化规律，此方法简单易操作，重复性好，精确度高，所用试剂无毒、无污染。

国外对硒形态测定的前处理方法也有报道，Selenium species in leaves of chicory，dandelion，lamb’s lettuce and parsley(Darja Mazej，Vekoslava Stibilj，et al.Food Chemistry，2008，107：75-83.)公开了一种单独利用蛋白酶水解样品然后进行硒形态测试的方法，该方法蛋白酶用量与样品的比例为1∶2～1∶5，成本很高。

所以，开发一种针对以硒代氨基酸为主要分析目标、低成本高效率的样品前处理及测试方法十分有必要。

发明内容

本发明的目的是克服现有硒形态测定技术特别是提取技术中存在的不足，提供一种操作简便，提取效率高，重复性好，成本低的富硒禽蛋中硒形态的测定方法。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下：

一种富硒禽蛋中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)富硒禽蛋的预处理：使用提取缓冲液Tris-HCl对研磨处理后的富硒禽蛋样品进行提取处理，如选用的富硒禽蛋样品是蛋黄样品先加入脂肪酶进行提取，然后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；如选用的富硒禽蛋样品是蛋白样品直接依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；