[发明专利]人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型及其构建和评价

说明书

技术领域

本发明提供了一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，属于肿瘤侵袭转移体外模型技术领域。

背景技术

肿瘤转移的过程是复杂而难以控制的，临床肿瘤病人的90％死亡率是由肿瘤转移导致的。某种程度上说，防止肿瘤转移即能控制肿瘤所致的死亡。肿瘤侵袭与转移是肿瘤细胞的恶性生物学行为，肿瘤侵袭也称为肿瘤直接扩散(direct spread)，瘤细胞不连续性播散，并在远隔部位生长的过程为转移(metastasis)。上述过程是一个复杂的、多步骤的过程，大致包括肿瘤细胞从原发肿瘤灶脱离；降解基底膜，向外浸润、迁移并粘附于血管内皮细胞；进入循环系统随着血流，到达并停留于远处的血管壁；穿过血管侵入细胞外基质，最后在特定的组织或器官形成转移灶。近年来随着分子生物学的发展，发现此过程分别受“转移相关基因”和“转移抑制相关基因”的调控，并且转移过程与各种细胞因子的功能失调密切相关。由于转移过程的复杂性，肿瘤转移的分子和细胞机制尚未真正阐述清楚。肿瘤转移复发的发生与癌细胞的生物学行为(黏附、运动、增殖、侵袭)、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成及靶器官性质等许多因素有关，而对于肿瘤转移机制以及抗肿瘤转移的评价手段的研究，不可能完全利用人体活检和尸检材料去完成，必需建立相应的动物和人类肿瘤的转移模型。对于肿瘤转移机制，实验治疗的探索是重要的工具和手段。在体外肿瘤侵袭转移模型中，传统的平面培养的转移性人肿瘤细胞系已经无法满足肿瘤侵袭转移分子病理机制的实验解析，且目前报道的大量平面培养的细胞系的表达与行为方面与体内癌细胞真实病理情况相差甚远[参考文献：Pampaloni，F.，E.G.Reynaud，et al.(2007).″The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.″Nature Reviews Molecular Cell Biology8(10)：839-845.]，而三维培养的类组织细胞球更接近体内肿瘤微环境内细胞的表达与行为，又因为体外三维培养易于大规模操作等优点，应用体外三维模型来探索和建立新型体外侵袭转移模型或转移研究体系可以为肿瘤转移新理论、新机制提供指导。

传统的平面培养细胞性状均一无极性，细胞形态影响细胞骨架，由此影响细胞的分泌功能及部分关键基因的异常表达，且平面培养细胞无法反映细胞与细胞之间，细胞与基质之间等相互作用，从而缺少有利的实验证据对细胞间粘附、信号转导、细胞运动侵袭转移等生物学过程进行体外模拟研究。体外三维培养技术克服了上述平面培养的不足，较好的模拟再现细胞在组织体内接近真实的生存状况，在细胞功能研究上，体外三维培养技术具有明显的优势，主要包括(1)简化体内复杂微环境，提供易于重复、规模化研究的特定体外模拟培养环境，有利于三维状态下细胞的分化，生长等生理病理特征解析。(2)在特定培养体系中，提高了同种细胞、异种细胞间的相互作用，结构上易于建立起与肿瘤转移密切相关的细胞间连接特性，比如缝隙连接，桥粒连接。(3)增强胞外基质的产量，易于观察胞外基质对细胞生长、分化、迁移等细胞生物学特征的影响。(4)体现出肿瘤细胞的肿瘤恶性度相关基因表达状况和相关功能特征。

发明内容

本发明的目的是构建既可以较好的模拟体内肿瘤的生存环境，也有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为实验解析的理想体外转移性肿瘤组织模型，解决体外研究肿瘤组织细胞病理特征缺少理想具有转移特性的实验模型问题以及肿瘤临床药物治疗缺少理想体外实验评估体系问题，提供可规模化的，易于重复研究又相对简化的肿瘤生长并具有转移特性的特定体外模拟培养环境。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，具体步骤为：

第一步：将人肿瘤细胞混悬在8-40g/L海藻酸钠溶液中，利用锐孔挤压法使液滴喷射入含CaCl₂凝胶浴，室温下反应10-40min生成粒径为200-800μm水凝胶微球，具有良好的单分散性；

第二步：将上述水凝胶微球自然沉降3-10min，沉降后按照5-15％的体积接种到含体积浓度8-15％胎牛血清的人肿瘤细胞培养基中，静置3-10min后，于培养箱中培养，在37℃，含体积分数5％CO₂的空气饱和湿度条件下培养人肿瘤细胞，培养基的种类依据所选定的肿瘤细胞确定。