[发明专利]富硒保健品中硒形态的测定方法

权利要求书

1. 一种富硒保健品中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）富硒保健品的预处理：使用提取缓冲液Tris-HCl对富硒保健品样品进行提取，提取处理后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；

（2）采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定；用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标法校正，按照公式（1）可计算得到待测样品溶液中硒代胱氨酸（Se-Cys2）、硒甲基半胱氨酸（SeMeCys）、Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）的含量；

X=C×V/m    (1)

其中： X为样品中待测物质的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；C为待测液中该物质的浓度，单位为微克每升（μg/L）；V为测定液体总体积，单位为毫升（mL）；  F为稀释倍数；m为称样质量（体积），单位为克（g/mL）。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取缓冲液Tris-HCl的浓度为100 mmol/L，pH7.5，液体保健品样品与提取液的比例（V:V）为1:5~1:10或者固体保健品样品与提取液的比例（m:V）为1:25~1:100。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取方法采用超声提取，提取时间为10~30 min。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶K与液体保健品样品的比例（m:V）为1：100~1：2000或者蛋白酶K与固体保健品样品的比例（m:m）为1：20~1：100；水解温度控制在40～55℃。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶XIV与液体保健品样品的比例（m:V）为1：100~1：2000，蛋白酶XIV与固定保健品样品的比例（m:m）为1：20~1：100；水解温度控制在30～45℃。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中水解处理后样品溶液在0～10℃下，离心处理后上清液过0.2～0.5 μm的滤膜，制得待测上清液。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时液相色谱及原子荧光条件为：

    流动相（40 mmol/L(NH₄)₂HPO₄，pH 6.0）；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时氢化物发生条件是：

    还原剂成分：0.35%NaOH+1.2%NaBH₄，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.35%NaOH+0.8%H₂O₂，流速：6 mL/min；载流：10% HCl，流速：6 mL/min。

9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法开机后对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸（Se-Cys2）、硒甲基半胱氨酸（SeMeCys）、Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）的保留时间依次为：2.6 min，3.2 min，4.0 min，5.0 min，待测样品中的硒代胱氨酸（Se-Cys2）、硒甲基半胱氨酸（SeMeCys）、Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5%之内即认为为该待测定物质。