[发明专利]一种鸡下丘脑神经元体外培养的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种鸡下丘脑神经元体外培养的方法，属于生物技术领域。

 

背景技术

    下丘脑神经元的体外培养，目前主要在小鼠、大鼠以及猪等上进行。哺乳动物与家禽的解剖结构有些不同，很多的研究表明，在一些食欲调节通路中，家禽的调节通路与哺乳动物相反，所以一些家禽的研究不可完全比照哺乳动物进行。     

    下丘脑位于丘脑腹侧，形成第三脑室底及腹侧壁的部分。可大致分为四个区，即前区、内侧区、外侧区与后区。下丘脑是联系神经调节和体液调节的枢纽。也是皮层下最高级的内脏活动调节中枢。目前研究了解到，下丘脑不是单纯的交感神经或副交感神经中枢，而是较高级的调节内脏活动的中枢；它能把内脏活动和其他生理活动起来，调节着体温、营养摄取、水平衡、内分泌、情绪反应、生物节律、短期记忆等重要生理过程，同时下丘脑也是家禽食欲调节的中枢。

    血-脑屏障是指存在于中枢系统神经组织和多种血源性物质之间的依存选择性的屏障。主要分布在神经组织内的连续型毛细血管内皮细胞的紧密连接构成。除O2、H2O、CO2和一些小分子脂溶性物质能透过这层屏障外，大分子物质和一些小分子物质只能经受体介导的转运和异化扩散才能选择性地进入脑组织。所以为了研究物质对下丘脑的实质性的作用，就必须跨过这层屏障，而离体培养就是很好的方法。

    神经元是神经系统的结构和功能单位，是高度分化的细胞，具有接受刺激和传到冲动的功能。神经元能合成和释放信息分子以及其他维持细胞生命所需的活性物质。每个神经元都是由胞体以及由包体延伸出来的突起构成。神经元从功能上分为：感觉神经元、中间神经元以及运动神经元三种。

    家禽与哺乳动物不同，很多应用在哺乳动物上的理论在家禽上都不成立，而且，体内实验干扰因子很多，并且还有血脑屏障的阻隔，神经元的体外培养很好的避免了这些干扰，可以很好的反映机体可能的反应。目前，对家禽的研究越来越深入，下丘脑神经元的体外培养，有助于进一步在家禽食欲以及其他方面的研究，意义重大。

发明内容

    为了解决上述问题，本发明提供了一种鸡下丘脑神经元体外培养的方法，目的是建立一种简单易行、高纯度的鸡下丘脑神经元细胞体外培养的方法，为提高家禽食欲以及其他下丘脑生理研究提供鸡下丘脑神经元细胞。

    一种鸡下丘脑神经元体外培养方法，包括以下步骤：

   （1）细胞培养板包被

配制浓度为0.01～0.25mg/L的多聚赖氨酸(Sigma)溶液包被细胞培养板（六孔板，每孔2ml），置于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育2小时以上，最好过夜。然后用DMEM洗一遍，再用双蒸水洗1～3遍，然后置于培养箱中，待完全干燥后备用。

（2）基础培养液配制

      用DMEM（Hyclone）、胎牛血清（Gibco）和马血清（Gibco）配制基础培养液，各组分的体积百分比为：DMEM80～94%、胎牛血清5～15％和马血清1～5％。

    （3）样品采集

取鸡下丘脑组织，用DMEM冲洗3-4次。

（4）组织分散

    将冲洗后的鸡下丘脑组织剪碎至1mm³大小，加浓度为0.1～0.25％的胰蛋白酶（Solarbio）溶液适量，37℃水浴5～15min。每隔3min剧烈摇晃一下。待鸡下丘脑组织块消化到几乎消失时，加入与胰蛋白酶等体积的步骤2）配制的基础培养液终止消化，然后过200目网筛，吸取悬浊液装入离心管，离心（5～15min，600～1500rpm）。弃上清液，加DMEM重悬，然后再离心（5～15min，600～1500rpm）。

    （5）细胞计数

将步骤4）离心后的悬浊液弃上清液，用步骤2）配制的基础培养液重悬，再用0.4％的台盼蓝染色计数，计算悬浊液中活细胞比例、细胞总数，以及可接板数；根据计数结果，在悬浊液中加入步骤2）配制的基础培养液，使悬浊液中细胞浓度达到5～20×105个/ml。

    （6）细胞接种

六孔细胞培养板每孔接种上述悬浊液2ml，接种24h后全换液，以后一周换两次液，每次均为半换液；

    （7）细胞纯化

      如果细胞培养48～72h时，观察到有杂细胞（如神经元胶质细胞）存在，每孔加入适宜浓度的阿糖胞苷(Sigma)，处理12～48h后，用步骤2）配制的基础培养液完全换液。