[发明专利]植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法

权利要求书

1.一种使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）植物转化受体的获得；

（2）构建粘合蛋白基因Mefp-5基因的植物表达载体；

（3）采用农杆菌介导法将Mefp-5基因转入烟草，获得转基因植株。

2.根据权利要求1所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于：步骤（1）中，使用烟草种子接种在MS 培养基得到无菌苗，无菌苗叶片切块在MS分化培养基上分化不定芽，不定芽接种在MS生根培养基中生根，建立烟草离体再生体系，再生的烟草植株作为基因转化受体。

3.根据权利要求2所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于：所述的MS分化培养基为MS 培养基+1.5mg/L 6-BA；MS生根培养基组成为MS 培养基+0.2mg/L NAA。

4.根据权利要求1所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步骤（2）包括以下步骤：

（A）利用PCR方法克隆粘合蛋白基因Mefp-5，测序鉴定；

（B）粘合蛋白基因Mefp-5上游连接CaMV35S启动子，下游连接NOS终止子后，形成的连接产物 CaMV35S- Mefp-5-NOS插入载体pCAMBIA 1300的多克隆位点构建植物表达载体，命名为pMF；

（C）采用冻融法将pMF和命名为pMFck的对照pCAMBIA 1300导入农杆菌LBA4404中，用于植物的遗传转化。

5.根据权利要求1所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步骤（3）包括以下步骤： 

（A）烟草叶片切块经农杆菌感染后，培养于MS筛选培养基中，诱导不定芽的分化；

（B）筛选培养基上进行抗性筛选培养40～50d，得到假定烟草转基因小苗；

（C）对转化烟草pMF、pMFck及其未转基因的亲本对照CK株系进行PCR、RT-PCR扩增，证明Mefp-5在烟草基因组DNA中的整合和表达，得到可表达粘合蛋白Mefp-5基因的转基因烟草。

6.根据权利要求5所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于：所述的烟草叶片切块为4周龄。

7.根据权利要求5所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于：所述的筛选培养基为MS分化培养基+ 30mg/L潮霉素+ 300mg/L头孢霉素。

8.根据权利要求5所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步骤（A）中农杆菌感染条件为：烟草外植体预培养2d，农杆菌浓度OD₆₀₀=0.6，浸染20min，不附加诱导剂乙酰丁香酮。