[发明专利]制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条(strip)的方法。更具体而言，本发明涉及一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑试纸条的方法，该方法包括将核苷酸探针与载体连接以制备结合物并通过真空转移将该结合物固定到多孔固体支撑上。

背景技术

在确定疾病的遗传因素、治疗的恰当性、生物鉴定等中利用核苷酸诊断。

通常，用于分析从细菌或细胞分离的核苷酸样品或者通过核苷酸聚合扩增该样品而获得的产物中的特定核苷酸序列的技术被用于证实核苷酸的存在，该技术采用具有与要被分析的部分核苷酸特异性连接的互补碱基序列的核苷酸片段(即，核苷酸探针)，这基于它们之间的确存在连接。

目前使用的用于分析特定核苷酸序列的方法的实例包括：通过将探针粘附到微孔板表面的特定核苷酸探针与要被分析的核苷酸的杂交，包括在膜上固定探针并向其加入扩增的核苷酸的特定核苷酸探针与核苷酸的杂交(逆向点/线印迹杂交)，以及包括在由如玻璃的材料制成的板上固定多种探针并向其加入扩增的核苷酸的核苷酸杂交(DNA芯片)等等。

为了制备用于核苷酸杂交的诊断条，需要一种用于在固体支撑上固定核苷酸探针的方法。

具体地，物理吸附、紫外线(UV)照射和包括共价连接的化学连接是将核苷酸粘附到固体支撑上的最常用的方法(参考：R Lutgarde等人，Applied Environmental Microbiology，62，300-303，1996)。

物理吸附是在固体表面物理吸附生物分子的方法，其在体外诊断中引起了极大的关注。

生物分子被吸附到固体相的机制并不清楚。实际上，可能涉及到生物分子与表面之间的相互作用。这种相互作用可能通过5个步骤发生，即，1)分子向表面移动，2)其吸附在表面，3)吸附分子的重排，4)吸附分子的潜在解吸附作用(latent desporption)，以及5)吸附分子离开表面的运动(参考：W Norde，Advances in Colloid and Interface Science，25，267-340，1986)。

该概要提示解吸附作用是潜在地固有的，但是，实际上，当分子足够大时，结合不可逆地发生(参考：AW Adamson，″The Solid-liquid Interface：Adsorption From Solution″，in Physical chemistry of surfaces，5th ed.(Chichester，UK：Wiley，1990)，421-459)。

该行为的原因是，由于结合位点的数量随着分子量的增加而增加，因此尽管一个结合位点从表面解离，但其余的多个位点仍然保持结合状态。就此而言，有报道称核苷酸表现出与蛋白质相同的作用。

尽管核苷酸的结合力比蛋白质的低，但大的核苷酸与膜结合良好。

但是，物理吸附存在的严重问题是固定在表面的核苷酸被重排并因此可能具有不适于与任何引入的碱基序列相互作用的构造。

具有长的碱基序列的核苷酸不会遇到问题，但当核苷酸的碱基序列变短时，潜在活性的降低会成为严重的问题。当碱基没有保持能与溶液相互作用的游离形式并被固定在表面上时，由于变形的结构，杂交不能正常发生。

此外，核苷酸探针具有的分子大小对于直接施用真空转移来说是小的，并且核苷酸探针具有的物理力(静电力、疏水性相互作用等)对于将探针吸附到多孔固体支撑上来说也是相对弱的，因此，将核苷酸探针固定到多孔固体支撑上时相当困难的。

因为这个原因，除非进行另外的固定，否则核苷酸探针可能未被均匀地涂覆，并且在检验过程中会容易地解吸附，因此核苷酸探针在应用于需要优良的再现性和高敏感性的分子诊断的杂交检验中是不利地无效的。考虑到这些问题，广泛地应用采用UV的方法。

UV交联是将核苷酸探针与尼龙膜共价结合的最简单的方法之一。连接主要通过胸腺嘧啶残基(其他核苷出现得不是这么频繁)来进行。当胸腺嘧啶残基被激活时，它们与存在于尼龙膜上的胺反应(GM Church and W Gilbert，PNAS，81，1991-1995，1984；I Saito等人，Tetrahedron Letters，22，3265-3268，1981)。

这些碱基中的一部分与膜表面共价连接，因此在杂交过程中不参与反应。当膜过度暴露于UV时，UV连接必然会干扰杂交。因此，重要的是正确地确定UV的照射量。