[发明专利]绿色木霉几丁质酶基因Tvchi及其表达产物与应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种绿色木霉几丁质酶基因Tvchi 及其表达产物与应用。

背景技术

几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。几丁质又称甲壳素或甲壳质,存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。自1921年发现真细菌和放线菌在含有几丁质的琼脂上可形成透明圈，从而证明这些培养物内有水溶性的几丁质酶存在以来，人们从未间断对几丁质酶的研究，多种微生物(细菌、放线菌、真菌)中分离和克隆了几丁质酶，并对微生物源几丁质酶的理化特性及生物学性状进行了大量研究。几丁质酶生产菌对真菌具有拮抗作用，在离体情况下也能抑制真菌的生长，且与其它细胞壁降解酶、植物病相关蛋白(PR)、杀菌剂、生防因子具有协同增效作用，因此几丁质酶应用于生物防治受到人们广泛的关注。

木霉菌(Trichodermaspp.)属于半知菌类的常见土壤丝孢菌，广泛存在于土壤、根围、叶围、种子和球茎等生态环境中，且可应用于植物病害生物防治。木霉菌能够分泌产生细胞壁降解酶类，其中几丁质酶尤为重要，而且不同种类的几丁质酶表现出对作用底物和病原微生物拮抗活性的特异性。Lorito 研究表明，木霉几丁质酶的生物防治效果要比植物、细菌和其他真菌的几丁质酶好。最初从哈茨木霉菌株发现分子量分别为42、37、33kD的3种内切几丁质酶。后来有学者确定了哈茨木霉P1菌株的5个几丁质酶基因Chi18-2、Chi18-3、Chi18-4、Chi18-10和Chi18-13。其中ThEn42是第一个被克隆的几丁质酶基因，该基因是目前进行遗传和转化研究的常用材料。 

发明人所在研究室从河南省不同小麦产区采集和分离获得12株木霉分离物，经小麦全蚀（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、纹枯病（Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven）及赤霉病菌（Fusarium graminearum）室内对峙实验，筛选获得1株对3种病原真菌均具有良好抑制效果的木霉ZBS-6菌株（菌种保藏号为CGMCC No.3538，专利文献号：CN102071145A），经形态分类学及ITS序列分析鉴定为绿色木霉（T.viride），已应用于田间小麦全蚀病防治试验。但目前对木霉及其几丁质酶基因的认识还很有限，现有一些几丁质酶基因的表达产物的生物活性及表达量难以尽如人意，且利用原核表达木霉几丁质酶活性较低；还有一些几丁质酶（如绿木霉UKM-1菌株几丁质酶等）对活性存在条件要求苛刻，制备、贮存成本高昂，这些因素制约着其在生物防治中的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的绿色木霉几丁质酶基因Tvchi，并构建了Tvchi原核表达载体，获得了高抑菌活性的绿色木霉几丁质酶。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明以ZBS-6为研究对象，克隆和原核表达分析了几丁质酶Tvchi基因，为木霉抗病基因及抗病机制的分子机理及作物病害生物防治提供了新思路。

一种绿色木霉几丁质酶基因Tvchi，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种由上述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi表达出的绿色木霉几丁质酶。

所述的绿色木霉几丁质酶，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

含有上述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

扩增上述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi全长或其任意片段的引物对。

所述绿色木霉几丁质酶在降解几丁质中的应用。

所述绿色木霉几丁质酶在制备杀菌剂中的应用。

本发明具有积极有益的效果：

1.构建了Tvchi原核表达载体，成功的获得了47kD左右的包涵体表达蛋白，通过咪唑洗脱、复性获得了具有高活性的表达产物，其制备不需其它表达系统复杂过程，为后续活性检测以及Tvchi功能域研究等提供了简便的方法；