[发明专利]包含免疫球蛋白Fc片段的长效人内皮抑素

说明书

技术领域

本发明属于生物制品制药技术领域，涉及一种长效重组人内皮抑素的制备方法。

背景技术

自Folkman于1971年提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”[Folkman J.N Engl J Med 1971；285：1182-1186]的观点以来，人们就把抑制肿瘤血管生成作为一种研究对象。血管内皮抑素(Endostatin)由美国O′Reilly等人于1997年首先发现。O′Reilly等人在试验中发现体外培养的鼠血管内皮细胞瘤(EOMA)的细胞培养液能抑制体外牛毛细血管内皮细胞增殖，他们从这种培养液中提纯出了一种新的蛋白质，并命名为内皮抑素(Endostatin，ES)。经鉴定表明鼠内皮抑素由胶原蛋白XVIII C末端区内184个氨基酸片段构成[O’Reily M S.et al.US 005854205A]。我国徐根兴等人也于当年在研究内皮抑素工作中发现了人的血管内皮抑素，并从人肝脏cDNA文库中筛选克隆得到人体血管内皮抑素基因[徐根兴等，CN1177005A]。内皮抑素的直接作用是通过抑制血管生长而起到抗肿瘤作用，并且不会导致抗药性产生。

恩度(Endostar)是我国自主研发的重组人血管内皮抑素(Recombinant Human Endostatin，rhES)，于2005年上市，用于非小细胞肺癌的治疗。它与天然的血管内皮抑素相比，在N端添加了9个氨基酸序列，提高了生物活性和稳定性。恩度与化疗药物长春瑞宾和顺铂(NP化疗方案)联用有一定的协同作用，可延缓患者的肿瘤进展。但是内皮抑素作为小分子蛋白，性质很不稳定，易于发生酶促降解并被清除，因此在体内的半衰期较短。而且，目前恩度临床用药量很大，在联合NP化疗方案用于治疗初治或复治的III/IV期非小细胞肺癌患者时，注射剂量为7.5mg/m²，每天静脉滴注3-4小时，连续给药14天为一周期。因此，提高rhES的体内半衰期，从而减少治疗剂量，降低患者痛苦以提高患者依从性成为一个急需解决的问题。

为了稳定蛋白质、预防酶促降解和被肾脏清除，可以使用诸如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)等具有高溶解性的聚合物来化学修饰蛋白质药物的表面。PEG分子具有两亲性，既可以溶于水，又可以溶于大多数的有机溶剂，无毒、无免疫原性，是可用于药物制备的高分子之一。通过与靶蛋白质的特定区域或各种区域结合，PEG能够提高血浆半衰期，增强生物利用度，减低蛋白质免疫原性、提高药物疗效及安全性等。另外，可通过在PEG两端连接同样的蛋白质药物来制备二倍体，以提高蛋白药物的活性。也可以将两种不同的蛋白质药物连接于PEG的两端，得到具有两种活性的药物组合物。

改善蛋白药物的体内半衰期还可以通过用基因重组技术，将药物蛋白的基因与编码具高血清稳定性的蛋白质基因相融合，从而生产融合蛋白药物。例如将蛋白质药物与白蛋白或其片段融合，或者与免疫球蛋白Fc片段融合。研究表明，药物与免疫球蛋白Fc片段融合，可以明显改善药物的体内半衰期。

不过，尽管PEG能增强蛋白质的稳定性，PEG偶联也存在一些问题，如降低蛋白生物学活性。此外，随着PEG分子量的提高，其产量也会有所降低等等。通过基因重组产生融合蛋白也具有一些缺点。例如，其导致所产生的融合蛋白的活性显著降低。蛋白质作为生理学功能性物质的活性是由蛋白质的构象决定的。当多肽药物通过重组方法与免疫球蛋白Fc片段融合时，利用原核细胞进行表达，融合蛋白常常发生错误折叠并以包涵体的形式表达；而利用真核细胞表达，免疫球蛋白Fc片段通常会被糖基化，从而可能引起体内的不良免疫应答。融合的接头区也可能对蛋白水解酶的降解作用敏感等等。

韩国韩美药品有限公司开发了一种新型长效重组蛋白或多肽药物的技术平台(WO 2005/047337)，其中公开了一种包含免疫球蛋白Fc片段作为载体的药物组合物可以延长蛋白或多肽药物的半衰期，并提高药物的体内生物利用率。然而，如WO 2005/047337中所记载，其所得重组蛋白或多肽药物最多仅保留约50％的体外细胞学活性。

本领域还需要在提高人内皮抑素的稳定性和体内半衰期的同时保留其生物活性，从而提高其生物利用度，减少治疗剂量，并提高患者依从性的长效rhES制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种长效血管内皮抑素制剂，从而增强血管内皮抑素在体内的稳定性，提高其有效血药浓度和生物利用度，并延长半衰期。本发明还提供了制备、分离和纯化长效血管内皮抑素制剂的方法，以及所述长效血管内皮抑素制剂在制备用于治疗癌症的药物中的应用。