[发明专利]一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗，其特征在于，该疫苗由DHV-VP1基因和甲病毒复制子载体pSCA1组成，所述DHV-VP1基因是DHV病毒的致病决定基因，其为DHV病毒基因中第2106至2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列：

ggtgattcca accagttggg ggatgatgag ccagtttgct ttctaaattt tgagacagct   60

aatgtcccaa tacaaggtga atctcacact cttgttaaac acctgtttgg gaggcaatgg  120

ttagttaaga ctgtgcaaca cgcttcaact gtgcaagagt tggacctcca agttccagac  180

agaggacatg cctctctcat tcagttcttt gtctattttt ctggagagat cattctcact  240

attgttaaca atggcactac accagcaatg gtagcacact cctattctat ggatgacctc  300

agttcagagt atgctgttac agcaatggga ggtgtgatga ttcctgctaa cagtgccaaa  360

aatatttctg taccattcta ctctgtaaca ccactcaggc caactcgacc aattcctggc  420

acatcagagg caacttttgg cagactgttc atgtggactc aatcaggaag tctttcagtt  480

tttatgggtc tcaaaaagcc agctctcttc tttccactcc ctgctcccac ctccacaata  540

ctaccacaga aatccaaaga tgttattccc acattgaatc agtctgggga tgaagtagat  600

tgtcacttct gcgaaatttg ctctaaaatg aagaggaggt ggaagccaag agggtacttc  660

agattttgcc ttaggctcaa aacactagca tctgaactca atctggaaat tgaa        714。

2.一种如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)DHV病毒总RNA的提取及纯化：将DHV ZJ08病毒株腿部肌注射两日龄的小鸭，待小鸭死亡后，取其肝脏制备研磨液，按常规方法提取DHV病毒总RNA；

2)设计特异性引物：根据DHV病毒VP1蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，在上游引物中引入Kozak序列：

VP1-F：5’-CGGGATCC BamH IGCCACCATG_kozak序列GGTGATTCCAACCAGTT-3’，

VP1-R：5’-TCCCCCGGG _Sma ITTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA-3’；

3)通过反转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到DHV-VP1的全长cDNA基因序列；

4)将步骤3)扩增的VP1片段，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP1 cDNA片段；

5)将VP1全长cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA1真核表达载体中，构建成鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗——抗DHV的pSCA1-VP1 DHV疫苗。

3.如权利要求2所述的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗的构建方法，其特征在于，步骤3)进一步包括：

在聚合酶链式反应中，反应程序为：95℃预变性5min，然后94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min后，10℃终止反应，于1％琼脂糖凝胶电泳胶回收聚合酶链式反应产物。

4.一种如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗在制备预防鸭病毒性肝炎药物中的应用。

5.一种如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗在制备治疗鸭病毒性肝炎药物中的应用。