[发明专利]一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法

权利要求书

1.一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法，其特征是按以下步骤：

（1）以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中任意两种酶组成复合蛋白酶，按照活力比为1:1-1:3将两种酶溶于磷酸盐缓冲液中配制成质量浓度为1.0-5.0%蛋白酶溶液，取配制的蛋白酶溶液加入pH4-10、质量浓度为2.0-6.0%的海藻酸钠溶液中，蛋白酶溶液与海藻酸钠溶液体积比为1:1-1:5；待充分搅拌均匀后，加入质量浓度为0.5-5.0%的氯化钙溶液中，移入4℃冰箱硬化2-6 h，过滤洗涤；然后加入体积分数为0.1-3%戊二醛溶液中，振荡0.5 h，于4-25℃静置交联4-6 h，用磷酸盐缓冲液将残余戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷风吹干表面水分得共固定化双酶；

（2）将新鲜鱼鳞浸泡洗净、烘干、粉碎、筛网、脱钙，脱除鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白；

（3）控制温度为40-60℃，pH在6-10，按鱼鳞重量比1-5%加入固定化双酶酶解，酶解时间为2-6 h，期间不断搅拌并加入酸液或碱液使反应体系维持在初始值pH值，酶水解反应结束后升温至100℃，保持10 min灭活，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000 r/min，离心分离15-20 min，得到上层的酶解液；

（4）在酶解液中加入质量比为0.5-3%食品级粉状活性炭，将水解液置于50℃的水浴锅内处理60 min，然后经5000 r/min离心获得上清液，即鱼鳞蛋白酶解液；

（5）鱼鳞蛋白酶解液经10 kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经3kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液和滤液；超滤过程中组件最大工作压力不超过0.15 MPa，依次得到分子量为10 kDa以上、3-10 kDa、3 kDa以下的鱼鳞多肽溶液；

（6）真空浓缩；

（7）冷冻干燥。