[发明专利]克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组方法，特别是涉及一种克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法。

背景技术

克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)是一种革兰氏阴性细菌，是克雷伯氏菌属(Klebsiella)的模式种，属于肠杆菌科。克雷伯氏肺炎杆菌目前主要作为2，3-丁二醇和1，3-丙二醇等化学品的生产用菌，同时，克雷伯氏肺炎杆菌可以代谢合成3-羟基丙醛、乙醇、乙偶姻、琥珀酸、乙酸、乳酸、氢气等化学品，克雷伯氏肺炎杆菌还可以作为宿主细胞构建3-羟基丙酸等化合物生产菌，使得克雷伯氏肺炎杆菌成为一种具有广阔工业化应用前景的微生物。

克雷伯氏肺炎杆菌与大肠杆菌亲缘关系比较近，有些大肠杆菌中使用的基因操作方法能应用到克雷伯氏肺炎杆菌。但是克雷伯氏肺炎杆菌特殊的细胞结构和遗传背景，使得克雷伯氏肺炎杆菌中没有高效的基因重组方法。目前已有的应用于克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法有利用质粒结合法和线性质粒转化法。

质粒结合法利用接合方法从大肠杆菌向克雷伯氏菌属细菌中引入自杀性质粒，使得处于质粒上的序列与染色体上的同源序列发生重组。利用该方法Guo等将自杀性质粒导入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366菌株，进而通过同源重组获得了荚膜多糖合成基因orf3的插入突变菌株[Guo，N.N.，et al.，Consequences of cps mutation of Klebsiella pneumoniae on 1，3-propanediol fermentation.Applied microbiology and biotechnology，2010.86(2)：p.701-707]，同样利用该方法Xu等在克雷伯氏肺炎杆菌HR526中敲除了乳酸脱氢酶基因[Xu，Y.Z.，et al.，Metabolism in 1，3-propanediol fed-batch fermentation by a D-lactate deficient mutant of Klebsiella pneumoniae.Biotechnology and bioengineering，2009.104(5)：p.965-972]。Horng等利用接合方式将自杀性质粒导入到克雷伯氏肺炎杆菌NTUH菌株中，通过同源重组成功将1，3-丙二醇合成途径氧化支路的dhaD和dhaK两个基因进行了失活[Horng，Y.T.，et al.Inactivation of dhaD and dhaK abolishes by-product accumulation during 1，3-propanediol production in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2010.37：p.1-10]。

线性质粒转化法，利用电击转化方法向克雷伯氏肺炎杆菌转入线性化的质粒，同样利用细胞本身具有的重组功能，使得位于线性质粒上的同源序列与染色体上的序列发生重组。Seo等在克雷伯氏肺炎杆菌Cu中，将两个长度为500bp的同源臂中间插入抗性标记基因，该片段链接到质粒上在大肠杆菌中进行复制，提取质粒后再通过酶切使得质粒线性化，将该线性质粒通过电转化进入细胞内，可以利用抗性标记选择发生同源重组的菌株，利用该方法成功将菌株的甘油脱氢酶基因和1，3-丙二醇氧化还原酶基因进行了敲除[Seo，M.Y.，et al.，Elimination of by-product formation during production of 1，3-propanediol in Klebsiella pneumoniae by inactivation of glycerol oxidative pathway.Applied microbiology and biotechnology，2009.84(3)：p.527-534]。