[发明专利]一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺

权利要求书

1.一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤：

(1)以林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)为出发菌株，经过⁶⁰Goγ射线诱变和原生质体紫外诱变选育；

(2)以经过改良的燕麦培养基为种子培养基，将斜面菌种接种至一级种子培养液中，摇瓶发酵培养40～44h后以7～10％的接种量接种至二级种子培养基中；

(3)二级种子培养液在通风搅拌式发酵罐中培养40～44h后以7～10％的接种量接种于特定的发酵培养基；

(4)继续在通风搅拌式发酵罐中进行发酵培养，于48～72h后结束发酵并收集发酵液；

(5)将发酵液转移至提取储罐中，过滤除菌体并收集滤出液；

(6)往滤出液中添加25％饱和度的硫酸铵进行沉淀，该过程要不断搅拌，待硫酸铵全部加完后，测定混悬液的pH值，并用0.1N的HCl溶液调节pH值至5.0，4℃离心并收集上清液；

(7)往上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为60％，4℃离心得沉淀；

(8)将沉淀溶于层析缓冲液中，不断搅拌使沉淀全部溶解，过滤清液；

(9)以市售的CM-Sepharose Fast Flow凝胶为离子交换层析介质，进一步分离纯化蛋白酶K，将层析介质装柱后，用层析缓冲液进行平衡，平衡后将沉淀溶解过滤清液上样，流速控制在线速度25-50cm/hr，上样完毕，用上述缓冲液冲柱，冲至流出液的OD_280nm小于0.1，换用洗脱液洗脱，流速控制在线速度25-50cm/hr，收集洗脱峰；

(10)采用超滤膜系统对洗脱峰进行浓缩脱盐，将浓缩脱盐液用0.22um滤膜过滤除菌；

(11)采用冷冻干燥技术，将过滤除菌液直接冷冻干燥，得到固体白色粉状成品蛋白酶K。

2.根据权利要求1所述的一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺，其特征在于，所述的⁶⁰Goγ射线诱变方法为：采用剂量为900Gy的γ射线照射3min，所述的原生质体紫外诱变为：将出发菌用液体种子培养基培养44h后离心得到菌体，加入高渗缓冲液溶解的蜗牛酶及纤维素酶，在32℃恒温处理1h，离心，用高渗缓冲液洗涤得到原生质体悬液，在15w紫外灯下，于30cm处，照射3min，然后将处理过的菌液混入软琼脂再生培养基，倾倒至再生培养基平板上。

3.根据权利要求1所述的一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺，其特征在于，所述的经过改良的燕麦培养基的成份为：燕麦粉12.0g/L，酪蛋白胨3g/L，甘氨酸0.05g/L，乳酸0.2ml/L，加水至1升。

4.根据权利要求1所述的一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺，其特征在于，利用一级种子培养液进行培养时采用以下步骤：斜面挑取1～2环菌体，在装液量10～20％(v/v)，培养液pH 5.0～6.0，摇床转速180～220rev/min，培养温度22～28℃的条件下培养40～44h。

5.根据权利要求1所述的一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺，其特征在于，利用二级种子培养液进行培养时采用以下步骤：以7～10％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，在10L通风搅拌式发酵罐中培养，培养条件为控制pH为5.0～6.0，温度为22～28℃，通气量1.2vvm，搅拌转速250～500rev/min，培养至40～44h时接种发酵培养基。