[发明专利]一种基于土臭素关键合成酶的荧光定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于土臭素（geosmin）关键合成酶的荧光定量PCR方法，检测不同样品中geosmin合成酶编码基因的含量（拷贝数），对食品，饮料，原料及生产环境中可能产生土霉气味物质geosmin的样品进行预测性判断，属于生物检测技术领域。

背景技术

Geosmin是具有土霉气味的一种异味化合物，该物质在极低浓度（ng/L级）下就能产生明显的土霉气味。对饮用水、水产业、养殖业、葡萄酒和苹果汁等风味饮品等造成严重的负面的感官影响。针对该物质采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测geosmin的产生情况，以采取相应措施阻断该化合物的污染。

目前，各国科学家已启动了geosmin的去除研究计划，并投入了大量的人力和物力对geosmin的产生机制开展研究。引领研究前沿的是美国布朗大学的化学教授David Cane。几年前，他发现了天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor）与合成geosmin有关的基因。2006年，该研究小组又发现了一种能将法尼基焦磷酸（FPP）转化为geosmin的具有双功能活性的germacradienol/geosmin合成酶。

通过将编码该双功能活性的germacradienol/geosmin合成酶全基因，氨基端突变基因，羧基端突变基因分别在大肠杆菌中转化并表达，检测其催化特性。发现在该酶氨基端和羧基端分别具有一个功能不同但代谢相关的结构域，在蛋白结构上表现为类似于哑铃状彼此相连的结构。氨基端结构域以FPP为起始底物催化合成germacradienol（合成geosmin的重要中间代谢物）和germacrene D，羧基端结构域催化germacradienol合成geosmin。分析该酶氨基酸序列，该酶的氨基端和羧基端都含有倍半萜烯合成酶类典型的氨基酸保守序列——NSE（天冬氨酸-丝氨酸-谷氨酸）三聚体。该酶是与制造geosmin等萜类物质相关且具有双重功能的第一种酶。随后，Giglio等人在产geosmin的藻类中发现相同的酶，同时报道该酶的羧基端结构域催化合成geosmin的最后关键一步。说明该酶在产geosmin的原核微生物中普遍存在。

自从发现并测序了geosmin在链霉菌和藻类中的编码基因后，人们开始探索应用PCR的方法来鉴定和评估geosmin的出现。国外已有学者建立了几种PCR方法来鉴定geosmin的产生菌，方法已比较成熟。Giglio等曾应用实时荧光PCR方法，通过绘制融解曲线检测和判定水环境中产geosmin的藻类。

在分析研究geosmin在微生物体内代谢途径和代谢关键点的基础上，通过对大曲或其他生产环境中geosmin关键合成酶编码基因的检测，能对geosmin的产生进行有效预测。从而可以提前采取相应措施，为从根源中去除我国白酒中由geosmin导致的土霉异味提供技术支撑。进而在白酒酿造过程中通过控制关键环境因素达到控制或抑制该化合物的合成，达到降低或消除白酒中土霉气味的目的。从而，改善白酒的感官品质，提高名优白酒的产率，对白酒行业的经济效益有明显的促进作用。

发明内容

本发明目的是建立一种无需菌落分离培养就能直接从白酒大曲中检测产土霉味化合物geosmin菌株的快速诊断方法。

本发明的技术方案：一种基于土臭素geosmin关键合成酶编码基因的荧光定量PCR方法，根据已报道的保藏菌株中geosmin关键合成酶（geoA）序列设计一对保守扩增引物，并调取上述菌株中geosmin关键合成酶编码基因；所述的扩增引物序列为：

245F：5’-TCTTCTTCGACGACCACTTCCT-3’，

551R：5’-CGGCGCATCTCGATGTACTC-3’；该引物为针对不同菌种中geosmin合成酶编码基因中的高度保守序列设计；

荧光定量PCR鉴别检测方法的步骤如下：

（1）提取总DNA模板：将待测样品大曲或酒醅采用Hoffman报道的方式提取基因组提取总DNA，最后加入30 μL无菌重蒸水融解；另设阳性对照为添加含有geoA的产geosmin菌株的样品；阴性对照为无菌生理盐水；

所述保藏菌株，即产土臭素geosmin的菌株，共四株，分别为：

①分类命名为白色链霉菌（Streptomyces albus）LBG-FXJ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4206；