[发明专利]组织特异性的重组质粒、病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种针对AFP阳性肝癌细胞的组织特异性重组质粒、病毒及其应用。

背景技术

肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，是临床上最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤的第五位。肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55％，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。

传统中药中提取的斑蝥素治疗肝癌虽然有显著效果，由于不具有组织特异性，对正常组织的毒副作用明显。斑蝥素作用的靶点是蛋白磷酸酶2A的活性C亚基(PP2Ac)。细胞内蛋白磷酸酶2A的活性C亚基(PP2Ac)是斑蝥素作用的靶点，是一个含Zn2+和Fe2+的金属酶，由309个氨基酸残基组成，其具有α和β两种异构体，有两个不同的基因编码，其同源性高达97％。PP2Ac广泛表达于各种细胞。由于斑蝥素通过抑制PP2Ac发挥杀伤细胞的作用时，并不能够区分肿瘤细胞和正常细胞，因此斑蝥素对正常细胞组织也具有毒性作用。

近年来，利用组织特异性基因启动子建立的基因治疗方法，为肿瘤靶向性治疗开辟了新的思路。基因的表达受其启动子的调控，启动子的转录活性与基因转录水平直接相关。某些启动子具有严格的组织特异性，即特定的启动子仅在特定的组织中存在活性。因此，某些基因仅表达于特定组织。如甲胎蛋白AFP的启动子在肝癌细胞中有很高的转录活性，因此AFP主要表达于肝癌细胞。利用肿瘤组织特异性基因的启动子，可以靶向性地在肿瘤细胞中表达某些抗肿瘤基因，从而实现针对肿瘤细胞的干预，减轻甚至避免对正常细胞的影响。

发明内容

本发明的目的是提供用于基因治疗的重组载体，通过重组载体将DN-PP2Ac导入细胞中，使DN-PP2Ac在细胞中过表达，从而抑制PP2Ac的活性，达到类似于斑蝥素的治疗目的，且控制DN-PP2Ac特异性表达于肝癌细胞，在正常细胞中不表达，从而避免对正常细胞组织的损伤，减轻毒副作用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

将具有肝癌组织特异性的AFP增强子、pgk启动子和DN-PP2A表达序列重组到腺病毒质粒载体中，使DN-PP2Ac的表达受到调控，仅在AFP阳性表达的肝癌细胞中能够表达出DN-PP2A，从而避免了对正常细胞的影响。

本发明提供一种重组质粒，由AFP增强子、pgk启动子和蛋白PP2Aca的负显性突变体基因与质粒载体重组构建而成。

AFP增强子具有组织特异性，但不具有强转录活性；pgk启动子具有强转录活性，但不具有组织特异性。二者结合可同时具有组织特异性和强转录活性。在本发明的具体实施例中，AFP基因的增强子序列和磷酸甘油酸激酶(pgk)基因的启动子组合形成的AFpg启动子，结合了AFP启动子的肝癌组织特异性和pgk启动子的强转录活性，适用于肝癌组织特异性基因治疗。AFP增强子核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，pgk启动子核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

作为优选，所述PP2Aca的负显性突变体为PP2Acα第199位亮氨酸突变为脯氨酸形成的负显性突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

显性负性作用是指某些信号转导蛋白突变后不仅自身无功能，还能抑制或阻断同一细胞内的野生型信号转导蛋白的作用。具有显性负性作用的突变体被称为显性负性突变体(dominant negative mutant)。

DN-PP2Ac(dominant negative PP2Ac)是PP2Ac的显性负性突变体。在本发明的实施例中，DN-PP2Ac是将PP2Acα第199位亮氨酸突变为脯氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，DN-PP2Ac通过质粒载体导入细胞中，使DN-PP2Ac在细胞中过表达，从而抑制PP2Ac的活性，其作用类似于斑蝥素。PP2Ac有两种亚型α和β，二者基因序列相近，同源性高达97％，功能基本相同。本发明如采用β亚型在同样的位点做显性负性突变，也具有抑制PP2A活性的作用。

更优选地，所述质粒载体为pGL3-basic。

在本发明实施例中，具体提供一种重组质粒，命名为pGL3-Basic-AFpg-DN-PP2Acα，其质粒图谱如图7所示。

本发明还提供一种重组病毒质粒，由AFP增强子，pgk启动子及蛋白PP2Aca的负显性突变体基因与病毒载体重组制备而成。所述病毒载体为腺病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。