[发明专利]一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法。

背景技术

巯基是细胞中化学活性最高的基团，是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。巯基分子的含量直接与多种疾病相关，如癌症，帕金森症，心血管疾病等。因而发展快速，灵敏，简便的检测巯基的方法在生物化学和临床化学中具有重要意义。传统的检测方法有质谱法，高效液相色谱法，电化学法，荧光法等，而荧光法由于其高灵敏度、宽动态响应范围等特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。

鉴于此，近年来巯基荧光探针得到了充分的发展并取得了较大的进步。如发展的芳基卤化物、丹磺酰氮丙啶类、芘类等，它们具有好的选择性和灵敏度，对巯基的检测限一般在纳摩尔（nmol）左右，但这些探针自身都有较强的荧光，用于活体细胞成像时会造成较低的信噪比；苯并呋喃磺酰卤类探针，虽然自身荧光较弱但是需要在碱性及高温条件下与巯基反应，也无法应用于活体细胞的荧光成像；而乙酰卤衍生物类巯基衍生试剂，能够在室温和生理PH下与巯基迅速反应，但是光稳定性较差，容易失去荧光团，因而也难以满足生物检测和荧光成像的要求。到目前为止，能够真正用于活体细胞内巯基定位成像的高灵敏，高响应的探针还比较少见。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种基于2,4-二硝基苯磺酰基修饰的二氟化硼-二吡咯甲烷类（BODIPY）化合物的可用于活细胞检测的高性能活性巯基荧光探针及其制备与使用方法。

检测生物巯基的荧光探针有两部分组成：2,4-二硝基苯磺酰基为识别基团，二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物为信息报告功能团，其结构如式I。

检测生物巯基的荧光探针的制备路线如下：

检测生物巯基的荧光探针的制备方法包括以下步骤：

步骤一，式II的制备：在氩气的保护下，将0.6～1.2 g间羟基苯甲醛与1～2 g 2,4-二甲基吡咯加入150 mL 的二氯甲烷中，搅拌溶解后，再加入0.5 mL三氟乙酸，在室温下搅拌反应10～15小时，待反应结束后，蒸干溶剂，以硅胶柱进行分离。

步骤二，式III的制备：在氩气的保护下，将1.2～2.4 g式II化合物溶于100 mL二氯甲烷中，并向反应体系内滴加溶有1.3～2.6 g 2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ）的二氯甲烷溶液100 mL，继续搅拌反应4～6小时后，将体系以冰浴冷却，再向反应体系内快速滴入10 mL三乙胺和15～30 mL三氟化硼的乙醚溶液，继续搅拌反应3～4小时，减压除去溶剂，残留物溶于100 mL二氯甲烷中，以100 mL水分两次洗涤后，有机相用无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂，残留物用硅胶柱层析进行纯化。

步骤三，探针分子的制备：在氩气的保护下，将0.5～1 g式III化合物溶于50 mL二氯甲烷中，以冰浴冷却，并加入0.5 mL三乙胺，搅拌10～15分钟后，向反应体系内滴加溶有1.2～2.4 g 2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液20 mL，待滴加完全后，升至室温继续搅拌10～15小时，减压除溶剂，粗产品用硅胶柱层析进行分离纯化，以二氯甲烷：石油醚 = 10：3为洗脱剂洗脱，得到探针分子纯品。

所述的检测生物巯基的荧光探针可应用于化学体系中含巯基化合物的检测，生物活细胞和活组织内的巯基的分析检测和荧光成像检测。

检测生物巯基的荧光探针的使用方法包括以下步骤：

步骤一，测量探针分子的核磁共振波谱及高分辨质谱数据

步骤二，测定探针分子对巯基的选择性

将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液。分别加入以PBS缓冲液溶解的待测样品，使最终探针分子的浓度为0.1 μM，而待测样品的浓度为2 mM。反应0.5小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而确定探针分子对巯基的选择性。

步骤三，测定探针分子对L-半胱氨酸的荧光-浓度曲线

将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液。分别加入不同浓度的L-半胱氨酸，使最终探针分子的浓度为0.1 μM。反应0.5小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而得到荧光强度对浓度变化的曲线。

步骤四，测定探针分子对L-半胱氨酸的荧光-时间曲线