[发明专利]一种丝状真菌启动子和包含该启动子的质粒

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种丝状真菌启动子和包含该启动子的质粒。

背景技术

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是一种研究植物病原真菌-寄主植物相互作用的丝状真菌模式生物，具有许多病原真菌共有的植物致病侵染循环，包括孢子产生、萌发、附着胞形成、侵染栓形成、侵入菌丝生长等致病过程。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界性的一种水稻上的毁灭性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产量损失在10～30％之间；我国几乎每年都有稻瘟病菌的流行爆发。许多发达国家正在进行研究其致病分子机制，期望通过此类研究开发具有抗瘟特征的水稻品种，以及开发、设计新型抗真菌药物。

稻瘟病菌的致病过程是一个复杂的分子过程。目前已经克隆了许多与稻瘟病菌致病性相关的基因，如：MPG1、CPKA、PMK1、MAGB、PLS1、SMO1、PDE1、MPS1、PTH11、CBP1、ICL1、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1、ATG1、MNH6等。尽管如此，稻瘟病菌的分子致病机制还不是很清楚，绝大多数的基因功能还未知。

鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是与侵入过程相关的基因，可以为开发具有抗瘟特征的水稻品种，以及设计、筛选抗真菌药物提供有用的参考。目前根据稻瘟病菌无毒基因和水稻抗病基因的互作关系，选育了很多水稻抗瘟品种；也已经在包括稻瘟病菌在内的一些真菌中证明了一些药物的靶点，如三环唑是一种很重要的稻瘟病菌杀菌剂，其作用是抑制黑色素的合成，靶点是稻瘟病菌的三羟萘还原酶；多肽杀菌剂sorphen A的作用靶点是青霉的脱甲基酶(CYP51)。

鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，需要分析蛋白在细胞内的定位、蛋白过量表达对植物病原真菌的作用等，这都需要一种丝状真菌细胞内蛋白快速表达和高效表达的系统。在工业用丝状真菌中，开发了构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)的启动子、产黄青霉的异青霉N-合酶基因启动子、康氏木霉和微紫青霉的Cbh1启动子、产黄头孢的宽光谱脂肪酶基N(cesB)的启动子等各种启动子。但在丝状病原真菌中，目前每个基因研究还都需要各自建立一个基因表达系统(如NAR启动子；RP27启动子)。公开号为CN102154294A的发明专利申请公开了一种丝状真菌启动子、终止子和包含它们的质粒，但该启动子驱动蛋白在稻瘟病菌中的表达、定位效果仍不理想，需要探索更加高效、通用的丝状真菌蛋白表达系统。

发明内容

本发明提供了一种丝状真菌启动子，利用该启动子可以在丝状真菌的菌丝、分生孢子、附着孢等各个阶段高丰度表达蛋白、DNA或RNA。

一种丝状真菌启动子，所述的丝状真菌启动子或其互补链具有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列，该丝状真菌启动子命名为H3启动子。

本发明提供了包含上述丝状真菌启动子的质粒。

优选地，所述质粒的原始载体为pCAMBIA1300，pCAMBIA1300载体含有卡那霉素抗性基因。以pCAMBIA1300载体作为基本构架，获得的穿梭表达载体可以通过农杆菌介导的方法直接转化丝状真菌，缩短了基因操作流程和时间，使用非常方便，具有较高的工作效率。

所述的质粒可以包含RP27终止子，RP27终止子或其互补链具有如SEQ ID NO.2所示的碱基序列。公开号为CN102154294A的发明专利申请公开了该终止子的获得方法。

所述的质粒可以包含抗性基因，作为抗性筛选标记。所述的抗性基因为磺胺嘧啶抗性基因或新霉素抗性基因。

所述的质粒可以包含绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因。

本发明提供了所述质粒在丝状真菌中表达蛋白、DNA或RNA中的应用。试验结果显示，利用该质粒能实现蛋白、重组蛋白或融合蛋白在丝状真菌中的快速、高效表达或准确定位。

本发明还提供了包含所述质粒的转化子。

本发明提供的丝状真菌启动子是一个强启动子，在稻瘟病菌的菌丝、孢子和附着胞阶段都能高强度启动。该启动子基因属于表达强度在稻瘟病菌细胞内稳定在前100位以内的基因。该基因是组蛋白基因，对于维持细胞的正常运转具有重要作用。

利用本发明提供的丝状真菌启动子，能够构建在丝状真菌中快速、高效表达的系统，从而便于研究蛋白在病原真菌细胞内的定位、蛋白过量表达对病原真菌的影响等。

附图说明