[发明专利]一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法，域。

背景技术

柳枝稷(Panicum virgatum)是禾本科黍属植物，植株高大，具有适应性好，耐贫瘠和对环境友好等优点，现在被作为是纤维素类能源植物中的首选植物。但其育种水平落后，分子育种可以大大加快其育种进程。杂种鉴定是遗传育种的基础工作，鉴定的真杂种可以为构建遗传图谱提供重要依据。柳枝稷是异花授粉植物，存在一定的自交率，如何快速准确鉴定出柳枝稷杂交后代的真实性是遗传育种的基础工作。

除形态学鉴定外，分子标记技术被广泛运用于杂交后代的真实性鉴定。例如在文献《结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定-SRAP分子标记》中报道的杂种鉴定的方法，利用9对具有父本特征带的引物组合对结缕草交后代的DNA进行PCR扩增反应。电泳分离扩增产物后，具有父本特征带的后代为真杂种，若无，则利用其他引物继续鉴定。

在《结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定-SRAP分子标记》一文中，为鉴定37个杂交后代的杂种真实性，筛选了9对具有父本特征带的SRAP引物，利用这些引物对杂交后代DNA进行PCR扩增，电泳分离扩增产物，具有父本特异条带的杂交种为真杂种。若没有扩增出父本特异条带，则更换引物扩增。最终共利用9对引物鉴定出杂交后代中有32个为真杂种。如图1所示。

03-2，03-4，03-5，03-6，03-7，03-8，03-9，03-10和03-11是以022为母本，123为父本的杂交后代。图中箭头所指接近300bp的条带为父本特异条带。则03-2，03-4，03-5，03-7，03-9和03-11具有父本特异条带，为真杂种。其余杂交后代需利用其他引物继续鉴定。

SRAP分子标记技术属于显性标记，若后代具有父本特异条带，则能肯定杂交后代是真杂种，若不具有父本特异条带，则不能立即判定其为假杂种，需要用其余引物继续鉴定。花费时间较多，成本较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法。

一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法，包括以下步骤：

A1，基因组DNA提取：

以待鉴定的柳枝稷植株幼叶或种子为材料，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA；提取的DNA用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行纯度的检测；将DNA样品置于-20℃冰箱保存；待开始实验时，将各个DNA样品取出一部分稀释至20ng/μL，放于4℃冰箱保存并使用；

A2，SSR分析：

利用筛选得到的柳枝稷EST-SSR标记引物：

primer1-F：5’-AGTTTGAGCTTTGTGTTTTTG-3’，

primer1-R：5’-CAACAATTTGGTTTCAACAAG-3’；

进行杂种鉴定；PCR反应扩增体系20μL：DNA 2μL(20ng/μL)，2×Taq PCRMasterMix 10μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)，灭菌水补齐20μL；

EST-SSR PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

电泳分离：最后PCR扩增产物采用1.8％的MetaPhor琼脂糖凝胶进行电泳分离，0.1mg/mL的溴化乙锭染色，120V电压在0.5×TBE缓冲液中电泳约1.5h，电泳结束后凝胶在凝胶成像系统中照相并保存；或者用PCR扩增产物在6％的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉＝19∶1，7.5mol/L尿素，1×TBE缓冲液)上用1×TBE缓冲液进行垂直电泳分离。首先在正极缓冲液中加入EB(终浓度：0.75μg/ml)，用300伏电压跑45分钟，然后点样，300伏电压跑2小时。电泳结束后凝胶在凝胶成像系统(Bio-rad)中照相并保存。

A3，杂种鉴定：在杂交后代的扩增产物中，若具有父本特异条带，则为真杂种，反之，则为假杂交种。