[发明专利]藏獒源犬细小病毒的分离鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种藏獒源犬细小病毒的分离鉴定方法，属于病毒学技术领域。

背景技术

藏獒生活在青藏高原，已有3000多年的育成历史，主要分布于我国西部地区的西藏、青海和四川等省区，不仅是我国特有的珍贵犬种，而且也是我国人民引以骄傲和自豪的保种动物。所以目前在所有品种的犬中只有藏獒的价格高居不下。尽管藏獒经历了漫长的自然和人工选择以及严酷的生存环境使藏獒具备了非一般犬所具备的智力、体能、适应性和抗病力，但是近年来，犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)对藏獒特别是藏獒幼犬的感染和危害越来越严重，其发病率和死亡率比一般的犬种更高，成为当前危害藏獒养殖业最严重的传染病。虽经注射过国产疫苗或进口疫苗，但仍有部分藏獒得不到有效保护，甚至有一些患犬久治不愈最终死亡。这不仅使许多藏獒养殖户经济上蒙受巨大的损失，而且导致藏獒的保种与市场开发受到极大的挑战。目前国内外对CPV分离鉴定的报道很多，但藏獒源CPV的分离鉴定却鲜有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种藏獒源犬细小病毒的分离鉴定方法。

藏獒源犬细小病毒的分离鉴定方法，包括以下步骤：

A1、病料采集与处理：临床上经CPV胶体金试纸检测为阳性的藏獒，将灭菌棉签伸入发病藏獒肛门，擦拭直肠壁，沾取肠黏膜上皮，将棉签头置于1.5ml EP管，加入无血清的DMEM至1ml；反复冻融3次，每次化冻后在振荡器上振荡1-2min后再进行下一次冻融；冻融后将液体转入15ml离心管中，用无血清DMEM反复冲洗、振荡棉签头3-4次，并将冲洗后的液体也转入离心管中，最后加无血清DMEM至10ml，制成10％混悬液；8000rpm离心10-15min；取上清液，0.22um微孔滤膜过滤后，置于-20℃备用；

A2、病毒分离：10％混悬液按1∶30-1∶60同步接毒F81细胞，加入含15％FBS的DMEM后，置于37℃、5％CO₂中2-4h，换液，PBS荡洗细胞1-2次，加15％DMEM，继续培养24h；每天观察细胞，配制含FBS 15％和5％的DMEM，根据细胞生长情况及时改变FBS的浓度；长满一层后仍不出现CPE，按常规方法传代，如传至第5代仍无CPE，则视为病毒分离阴性；细胞若出现大面积CPE时收细胞和上层培养液，反复冻融3次，10000rpm，离心10-15min；取出上清，调节PH值到7.2-7.5，加入乙二醇至最终浓度为8％(w/v)；置于4℃中2h后，11000rpm，浓缩2h，加入少量无血清DMEM溶解病毒团块，置于-20℃中备用；

A3、PCR鉴定；根据GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分别设计扩增VP2片段的特异性引物一对：P1、P2；扩增VP2全基因的特异性引物一对：P3、P4；扩增的目的片段大小分别为825bp和1755bp；由上海Invitrogen公司合成，引物序列为：

上游引物P1：5’-AACGGATGGGTGGAAATCAC-3’；

下游引物P2：5’-TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3’；

上游引物P3：5’-CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3’；

下游引物P4：5’-AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3’。

本发明从8份患病藏獒的直肠棉拭子中成功分离到6株CPV，分析比对其VP2全基因序列，均为CPV-2a。1978年首次发现CPV至今已有CPV-2，CPV-2a，CPV-2b，CPV-2c等亚型，国内CPV仍以CPV-2a流行为主。病毒由CPV-2进化为CPV-2a是由于VP2上四个氨基酸残基位点(L87M，I101T，A300G，D305Y)发生了变异，本次分离的6个毒株在上述四个位点的变异情况与CPV-2a的相同，说明CPV在藏獒中的流行情况与在国内的流行情况一致。

本发明尝试了用直肠棉签拭子法采样，既能保证样品的新鲜度、减少污染，又能及时采到样品、节约采样时间。

附图说明