[发明专利]一种共聚焦显微成像的获取方法和装置

说明书

技术领域

本发明属于共聚焦显微领域，具体涉及一种共聚焦显微成像的获取方法及装置。

背景技术

普通的显微镜在获得聚焦处信息的同时也获得离焦处的信息，该离焦信息会影响观察到的图像，其效果犹如在聚焦处铺上了一层“薄纱”，大大降低了图像的对比度。所谓的共聚焦显微镜，可以尽量多的抑制聚焦处之外的杂散光，以保证获得的图像主要是来自样品聚焦处的信息，即像面和观察面是完全“共轭”的，去除了“薄纱”的影响，对比度更高，且可分层获得样品的信息，也就是光学共聚焦图像，再用这些二维共聚焦图像可以在不破坏样品的情况下重建出样品的三维图像，非常适合于活体观察，并已成为生物医学研究、材料科学和半导体等领域的重要工具。

传统的激光扫描共聚焦显微镜，是在普通荧光显微镜的基础上增加了“共聚焦技术”和“激光扫描技术”。共聚焦技术，就是在共聚焦显微镜的光路中设置了两个共聚焦针孔即照明针孔和探测器针孔，并与样品的聚焦点共轭。激光光源发出的激光束，通过照明针孔后成为点光源，经物镜成像在样品上为一个聚焦点，从聚焦点发出（或反射）的光反方向经物镜成像在探测器针孔处，也就是说，放置在探测器针孔后面的探测器只能接收来自聚焦点的光，减少了非聚焦处杂散光的干扰，从而提高获得图像的对比度。这就是一个点物体的共聚焦成像原理，需要配合对样品的逐点扫描才能实现样品的二维共聚焦成像。一般采用激光扫描技术实现对样品的二维扫描成像，即在光路中安装两个检流镜（Galvanometer mirror），其转动角度可控制，分别用于控制光束对样品进行X和Y方向的逐点扫描成像，以获得样品某个深度的共聚焦图像，改变载物台的轴向（Z方向）位置，并获得一系列样品不同深度的共聚焦图像，即可在不破坏样品的情况下对样品进行三维重建，实现活体的三维观察。激光扫描共聚焦显微镜LSCM的横向分辨率接近于普通显微镜的2倍，轴向分辨率可达到几百纳米，虽然如此，但由于存在共聚焦针孔，抑制了绝大部分的杂散光，照明效率很低，使得探测器接收到信号很微弱，需要高灵敏度的光电倍增管PMT作为探测器，但其量子效率低，获得的图像信噪比低；另外，由于采用逐点扫描成像，成像速度过慢，不利于活体的观察；还需要激光作为光源，成本高。

激光扫描共聚焦显微镜是基于单光束扫描成像，效率低，成像速度过慢，不利于活体的观察。碟片共聚焦显微镜是基于多光束扫描的方法，速度大大提高，可以实时成像。其具体原理是在样品聚焦平面的共轭面上放置一个可以旋转的碟片，该碟片上开有很多针孔，光源发出的光经过这些针孔后形成许多点光源，经过物镜成像在样品的聚焦平面上，从样品聚焦点发出（或反射）的光反方向经过物镜成像后又聚焦到原来的针孔上（即碟片上的针孔同时充当照明针孔和探测器针孔），通过分色镜后成像在面阵探测器上，这样可以同时多个点成像，再配合碟片的高速旋转，可以实现快速的二维成像。旋转盘上的微透镜阵列是用于提高照明效率，可以进一步提高成像速度。相对于激光扫描共聚焦显微镜，由于多点成像，采用面阵CCD探测器，速度较高，也不需要激光作为光源；多点成像也带来些不足，一是杂散光会通过邻近的针孔进入探测器，降低图像的对比度，影响分辨率；二是碟片的针孔大小是固定的，不像激光扫描共聚焦显微镜的探测器针孔是可以调节的，也就不能改变分辨率；三是不支持ROI（Region of interest）功能；四是系统更复杂、昂贵。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种扩展性好、系统简单的共聚焦显微成像的获取方法及装置。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种共聚焦显微成像的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：

a）采用一空间光调制器件，同时作为可编程的照明针孔和探测针孔；

b）将上述空间光调制器件分成若干类微镜；

c）设定摄像头的曝光时间；在摄像头曝光时间内，依次开启同一类的微镜；

d）直到所有各类微镜开启一遍后，摄像头停止曝光，即可获得一幅共聚焦图像。

优选的，步骤a）中，所述的空间光调制器件为数字微镜器件DMD。