[发明专利]带有荧光素酶标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种带有Rluc标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法，同时还涉及一种带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆在制备病毒的能力及药物筛选中的应用。

背景技术

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，其基因组为单股正链RNA，长度约为7.5kb，编码约2200个氨基酸。基因组编码的多聚蛋白可切割成3个前体蛋白(P1、P2、P3)。其中，P1前体蛋白可切割4种病毒结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)。P2和P3前体蛋白可切割为7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)；P3区在进化过程中高度保守。ORF的两侧分别为5’和3’非编码区，另外在3’非编码区末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸(polyA)。

EV71的感染能够引起人的手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病，严重时可危及生命。其传播途径主要经由胃肠道或呼吸道传播，也可经由接触病人皮肤水泡的疱疹液而受到感染。自1974年，EV71被首次报道以来，已在马来西亚、澳大利亚、新加坡、日本，中国台湾和中国大陆等国家和地区爆发和流行。在我国，很多地区都曾有散发病例的报道，直到2008年EV71的爆发流行(手足口病病例488955例，死亡126例)，才引起了整个社会的关注。因此，2008年4月，国家卫生部颁发了《肠道病毒(EV71)感染诊疗指南(2008版)》和《手足口病预防控制指南(2008版)》，并在同年5月将手足口病纳入丙类法定传染病管理。2009年，我国部分地区手足口病病例呈现增多的趋势。针对严峻的现状，广大的科学工作者以EV71为对象，从病毒的生物学特性、致病机理、诊断试剂和疫苗的研究等方面做了大量的工作。但是，目前仍然缺乏特效的治疗手段。因此，继续深入的开展相关的研究，如病毒的分子生物学特性、复制机制、致病机理等，将有利于人类更加全面透彻的了解EV71，从而为设计有效的药物、准确的诊断方法和试剂以及良好的疫苗提供理论依据。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。目前，该技术已经应用到了许多不同的病毒研究中，如西尼罗病毒，登革病毒，狂犬病毒，牛病毒性腹泻病毒等，建立了相应病毒的反向遗传学平台(全长感染性克隆)，以这些平台为基础开展了关于病毒的复制机制、致病机理和疫苗的相关研究，并取得了突破性的进展。同时，相关的科学工作者在构建的全长感染性克隆的基础上进一步的设计了带有不同标签的全长感染性克隆。这一新的反向遗传学平台为开展相关的科学研究提供了相比于不带标签的病毒全长感染性克隆更便捷的优势。

因此，本发明提供了一种带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆，为深入开展EV71的基础研究和应用研究提供了有效的平台。本发明具有十分重要的理论意义和现实意义，同时具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆的制备方法。通过该方法，可获得带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆。将获得的EV71全长感染性克隆体外转录为RNA，并将其转染Vero细胞，通过细胞病变的观察、Rluc活性的检测和病毒蚀斑实验证明了带有Rluc基因的EV71全长感染性克隆具有稳定产生EV71的能力，并且产生的EV71的生物学特性与亲代病毒相似。

本发明的另一个目的是在于提供了一种带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆在制备病毒的能力和药物筛选中的应用，EV71的感染能够引起人的手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病，严重时可危及生命。实验证明，以构建的带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆为平台，使用已知对EV71具有抑制作用的盐酸胍测试本发明所构建的平台在抗病毒药物筛选中的有效性，结果表明本发明能够很好的应用抗病毒的药物筛选。另外，本发明也在研究EV71的动物模型、病毒的复制机制与致病机理、药物的作用机制、疫苗和诊断试剂的研发等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种带有Rluc标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法，其步骤是：

1.总RNA的提取：